HIV/HCV混合感染者与HCV感染者感染HCV基因型分析*

邓浩辉，李晓强，高洪波，陈伟烈

由于感染途径的差异，人类免疫缺陷病毒（HIV）/丙型肝炎病毒（HCV）混合感染与HCV感染者的HCV基因型分布可能并不一致。本研究应用二代测序技术对广州地区HIV/HCV混合感染者与HCV感染者感染HCV基因型进行了检测，现将结果报道如下。

1 对象与方法

1.1 研究对象 2012年～2016年广州市第八人民医院门诊或住院的HIV/HCV混合感染者和HCV感染者被纳入研究。HCV感染的诊断符合2015年中华医学会肝病学分会发布的《慢性丙型肝炎防治指南》的诊断标准[1]，HIV感染的诊断符合2015年中华医学会感染病学分会艾滋病学组发布的《艾滋病诊疗指南第三版》[2]。排除标准：混合其他病毒性肝炎、酒精性肝病、脂肪肝、药物性肝损伤和自身免疫性肝炎，排除既往曾使用过抗病毒药物治疗的慢性丙型肝炎（CHC）患者，排除血清HCV载量在检测线以下的患者。所有入选对象均签署知情同意书，本项目已通过医院医学伦理委员会审查。

1.2 HCV基因分型检测 使用MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kits试剂盒（Takara，大连）提取血清HCV RNA。使用PrimeScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒（Takara，大连）和 HCV特异引物（HCV RT：5'-GGRGCDGARTACCTRGTCAT-3'，nt 8693-8712，JFH-1，AB047639） 行逆转录。使用HCV Core和NS5B基因片段行HCV基因分型。HCV core基因片段产物为401bp，扩增引物为 ：外引物：F15'-TGGTACTGCCTGATAGGGTGCTTGC-3'，R15'-GGATGTACCCCATGAGGTCGGC-3'；内引物 ：F25'-TCGTAGACCGTGCATCATGAGCAC-3'，5'-R2：CCGCAYGTRAGGGTATCGATGAC-3'。HCV NS5B基因片段产物为375bp，扩增引物参考文献报道[3]。本研究在内引物的5'端加入6个已知序列的随机碱基（barcode），分离各样本测序数据。使用PrimeSTAR高保真酶（Takara，大连）扩增HCV Core和NS5B基因片段，第一轮反应条件如下：95°C 预变性 3 min；95°C变性 15 s，55°C退火5 s，72°C延伸30 s，共30个循环；72°C再延伸3 min。第二轮反应条件如下：95°C预变性 3 min；95°C 变性 15 s，55°C 退火 5 s，72°C延伸30 s，共30个循环；72°C 再延伸3 min。为评估逆转录、PCR和测序过程中引入的错误，我们使用了包含HCV Core和NS5B基因片段的质粒（HCV 6a型），将其体外转录为RNA（T7 High Yield RNA Transcription Kit，诺唯赞，南京），与检测标本同步行逆转录、PCR和测序。对PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳后，使用Image J软件对其进行灰度值计算，相近灰度值的样本归类为同一分组进行混样（10～15个样本为同一组），对混样的样本使用Takara公司的胶回收试剂盒进行回收，对回收产物使用Nanodrop2000核酸定量分析仪定量，取每样本DNA 30 ng送上海美吉生物公司测序，建库试剂盒为NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina（NEB，美国），测序仪为 Illumina Miseq，测序模式为PE300。应用 FASTX Toolkit软件的FASTQ Quality Filter组件过滤原始数据，剔除低质量分数的reads（Q30＜80%）。应用Geneious R10.0.5软件对过滤后的原始文件与HCV参考序列比对，剔除非HCV序列。应用Geneious R10.0.5软件对测序数据3'端序列行末端修剪，将末端允许错误率的阈值设置为小于1%。然后，根据预设的barcode对各样本数据进行分离。应用FLASH V1.2.9程序对序列进行拼接[4]。应用Geneious R10.0.5软件对拼接后的样本过滤长度大于或小于目的片段的序列。根据参考文献[3]，从NCBI Genbank数据库下载广东地区常见的HCV基因型的参考序列，具体如下：HCV 1a（AB520610、EU781824），HCV 1b（D10934、L02836），HC V2a（D00944、AF238482），HCV 3a（AF046866、D17763），HCV 3b（D49374）和 HCV 6a（AY859526、Y12083）。应用 Geneious R10.0.5 软件的“Map to reference”组件对HCV Core和NS5B基因片段测序数据对多序列比对，软件参数如下：灵敏度设置为自定义灵敏度（custom sensitivity），每条read最大错配率设置为10%。对HCV Core和NS5B二代测序数据均提示存在混合基因型可能的样本（参考二代测序的错误率[5]和本研究质粒片段分型的错误率，即超过该样本1%以上的reads比对至其他基因型的样本），应用HCV NS5A基因型特异引物（in-house引物）再次进行扩增，以验证HCV混合基因型的存在。

1.3 统计学方法 对本研究获得的呈正态分布的计量资料以（±s）表示，对偏态分布的计量资料以中位数（四分位数间距，IQR）表示，计数资料以例数（%）表示。应用SPSS 13.0软件分别行t检验、Mann-Whitney U检验、x2检验或Fisher确切概率法计算，P＜0.05为差异有统计学意义，均取双侧检验。

2 结果

2.1 HCV感染者一般资料 在纳入的233例HCV感染者中，HIV/HCV混合感染者与HCV感染者性别、年龄、血清ALT水平和HCV RNA载量方面比较，无显著性差异（P＞0.05）；HIV/HCV 混合感染者静脉吸毒构成比显著高于HCV感染者（P＜0.001）；HCV感染者输血感染的构成比显著高于HIV/HCV混合感染者（P＜0.001，表1）。

表1 HIV/HCV混合感染和HCV感染者一般资料【%，（±s），M（IQR）】 比较

表1 HIV/HCV混合感染和HCV感染者一般资料【%，（±s），M（IQR）】 比较

HIV/HCV混合感染（n=95） HCV感染（n=138） P性别（男 /女） 84（88.4）/11（11.6） 114（82.6）/24（17.4） 0.222年龄（岁） 43.0（36.0～53.0） 43.0（35.0～49.0） 0.442 CD4细胞（个/mm3） 253（123.0～410.0） 无数据 -血清 ALT水平（u/l） 74.2±85.8 75.2±72.0 0.925 HCVRNA（lgcopies/ml） 6.3±0.7 6.4±0.8 0.353 HCV感染危险行为静脉吸毒 74（77.9） 27（19.6） ＜0.001未保护性性行为 14（14.7） 10（7.2） 0.093输血 3（3.2） 67（48.6） ＜0.001其他/未知 4（4.2） 34（24.6） -

2.2 二代测序错误发生情况 为评估二代测序的错误发生情况，应用HCV质粒Core和NS5B基因片段行二代测序，结果Core基因片段数据量为20520 reads，NS5B基因片段数据量为18752 reads。序列比对结果提示Core基因片段20400 reads（99.4%）为HCV 6a基因型，NS5B基因片段18672 reads（99.6%）为 HCV 6a基因型。参考既往研究的二代测序错误发生率和本研究质粒测序的错误率，本研究定义1%以上的reads比对至其他HCV基因型为存在混合基因型感染的可能。

2.3 两组HCV感染者病毒基因测序数据量的比较 HIV/HCV混合感染者HCV Core基因片段测序的数据量为（15456±6689）reads，HCV感染者为（14323±5321） reads（P>0.05）；HIV/HCV 混合感染者HCVNS5B基因片段平均数据量为（16432±3467） reads，HCV 感染者平均数据量为（17611±5632） reads（P>0.05）。

2.4 两组HCV基因型比较 在本研究纳入的233例HCV感染者中，228例（97.9%）为HCV单一基因型感染，5例（2.1%）为HCV混合基因型感染者，其中HIV/HCV混合感染者4例（4.2%，1b型/6a型1例，1b型/3b型2例，3b/6a 1例），HCV感染者1例（0.7%，为2a/6a型）。两组HCV感染者混合基因型构成比无显著差异（P=0.071）。HIV/HCV混合感染者感染HCV 6a型和3b型者显著高于HCV感染者（P=0.001，P=0.005），而感染 HCV 1b型者显著低于单一 HCV感染者（P＜0.001，表2）。

表2 HIV/HCV混合感染者与HCV感染者HCV基因型（%）比较

3 讨论

根据Simmonds分型方法和目前文献的报道，HCV可分为7个基因型和多个基因亚型[6，7]。HCV分型方法包括基因型特异引物和探针PCR扩增、限制性片段长度多态性分析[8]、反向杂交线性探针技术（INNO-LiPA法）[9]和测序法，其中测序法为分型的金标准，包括直接测序法和二代测序。直接测序法仅能检测HCV主要的基因型，二代测序具有高灵敏度的特点，能准确对HCV分型并检测HCV混合基因型感染的存在[10，11]。

本研究纳入广州地区233例HCV感染者，包括HIV/HCV混合感染者和HCV感染者，以二代测序技术进行HCV基因检测，结果发现广州地区HIV/HCV混合感染者HCV基因型以HCV 6a型为主，HCV 3b和6a型的构成比显著高于HCV感染者，而HCV感染者以1b型为主，HCV 1b型的构成比显著高于HIV/HCV混合感染者。另外，在233例HCV感染者中，发现5例患者存在HCV混合基因型感染，其中4例为HIV/HCV混合感染者，1例为HCV感染者。

HCV基因型在国内以1b和2a型为主，其分布在不同地区并不一致，如西南地区HCV 3b型的流行明显高于其他地区，中国南方地区HCV 3型和6型的比例高于全国的平均水平[12]。既往研究表明HCV基因型的分布与HCV感染途径明显相关[13-15]。在本组HIV/HCV混合感染者中，主要的HCV感染途径为静脉吸毒，而HCV感染者主要的感染途径为输血。因此，HIV/HCV混合感染者3b和6a基因型构成比显著高于HCV感染者，可能与感染途径不同有关。根据文献报道，HCV 3型感染者对直接抗病毒药物（DAAs）治疗的应答较差，而在HIV/HCV混合感染者中，HCV 3b型的构成比较高，应予重视。

国内外学者的研究结果表明，HCV感染者存在HCV混合基因型感染的现象。过去本地区报道的研究仅采用灵敏度较低的方法进行HCV基因型分型，难以发现HCV混合基因型的存在。本研究使用二代测序对本地区HCV基因型进行了检测，结果发现5例患者存在HCV混合基因型感染，且5例患者的感染危险途径均为静脉吸毒，推测静脉吸毒者多次使用不洁注射器，可能是导致不同HCV基因型混合感染的原因。