地塞米松联合DPSCs对糖尿病Beagle犬种植体周围炎龈沟液中炎症因子及TGF-β3的影响*

王根桃， 林 毅， 林赛云

(1. 福建省肿瘤医院口腔科， 福州 350014； 2. 福建医科大学省立临床医学院口腔科， 福州 350000)

糖尿病是以高血糖为主要特征的代谢性疾病，据2015年IDF统计，我国现约有1.1亿糖尿病患者，位居世界之首[1]。糖尿病患者易产生多种并发症，其中，种植体周围炎是糖尿病患者口腔种植后最易发生的并发症之一，其可导致种植体周围软、硬组织受到炎症性损害，促进牙槽骨吸收，使得伤口愈合减慢、并增加感染的风险[2]。牙髓干细胞(dental pulp stem cells，DPSCs)是存在于牙髓组织中的一种间充质干细胞，具备自我更新、多向分化、高度增殖等特点，在牙体牙髓修复、组织种植再生方面具有重要的应用前景[3]。然而，目前关于DPSCs治疗种植体周围炎的实验研究较少，其治疗机制并不明确。本实验拟以糖尿病Beagle犬为研究对象，建立糖尿病后种植体周围炎模型，采用地塞米松喷雾剂和DPSCs联合干预，明确其治疗效果并探讨可能机制，对于糖尿病种植体周围炎的临床防治具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康雄性Beagle犬9只，清洁级，12月龄，体重10～12 kg左右，购自南京军区福州总医院。经检查，所购Beagle犬牙齿排列整齐、牙列完整，无慢性牙周病及龋齿病，咬合能力正常，购入后适应性饲养一周。

1.2 试剂与主要仪器

肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)、白细胞介素-1β(interleukin-1β, IL-1β)、白细胞介素-6(interleukin-6, IL-6)、转化生长因子-β3(transforming growth factor-β3, TGF-β3)试剂盒均购自美国R&D公司；Strol-1、CD146单克隆抗体、四氧嘧啶均购自美国Sigma公司；血糖测量仪、血糖试纸购自美国Johnson公司；Bio-Oss骨粉、Bio-Gide膜购自瑞士盖氏公司；MD-20种植机、钛种植体购自瑞士Straumann公司；MK3型酶标仪购自美国Thermo公司；5417R低温高速离心机购自德国Eppendorf公司；倒置荧光显微镜购自日本Olympus公司。

1.3 DPSCs分离与培养

参照文献方法[4]，取Beagle犬上下颌双侧第2、4前磨牙作为DPSCs来源及种植手术区域。将牙置于预冷的PBS中，剪开牙冠及牙根，取出牙髓并充分剪碎，置于含胶原酶和Dispase酶的混合消化液中，培养箱中消化40 min后离心，收集细胞，加α-MEM培养基(内含10%胎牛血清、1%双抗及0.25%谷氨酰胺)重悬，接种至培养瓶中。培养24 h后，取培养瓶于显微镜下观察细胞生长状态及形态。

1.4 DPSCs的鉴定

采用免疫荧光法检测DPSCs标记物Strol-1、CD146，鉴定是否为DPSCs，具体操作如下：将细胞接种至96孔板中，培养2～3 d后，弃掉孔内液体，预冷的PBS润洗2次；采用4%多聚甲醛液固定细胞30 min，润洗，加入0.25% Triton-100处理15 min，润洗，再经5% BSA封闭30 min，润洗完成后，各孔加入Strol-1或CD146单克隆抗体稀释液(1∶100)，置于4℃湿盒中避光孵育过夜；次日弃液，预冷PBS洗3次，加入荧光二抗稀释液(1∶200)，37℃避光孵育1 h；弃液，预冷PBS洗3次，加入DAPI工作液，室温下避光孵育15 min，弃液，润洗3次，于倒置荧光显微镜下观察标记蛋白的表达情况，分析DPSCs纯度。

1.5 糖尿病Beagle犬种植体周围炎模型的建立

动物于造模前禁食12 h，给予一次性腹腔注射四氧嘧啶(50 mg/kg)建立糖尿病模型，于注射72 h后测定动物空腹血糖值，空腹血糖值≥13.90 mmol/L视为糖尿病犬。此后连续正常饲养4周，每周监测动物血糖值，其值稳定在13.90 mmol/L以上说明糖尿病Beagle犬模型建立成功。然后，将Beagle犬所有拔牙位点植入种植体，种植后8周达到骨结合程度，于种植体位点建立种植体周围炎感染模型[5]。根据临床种植体周围炎的诊断标准，观察种植体周围软组织是否肿胀发红、探诊出血、种植体周围结合上皮附着丧失等症状，判断模型是否建立成功。

1.6 动物分组与给药

9只Beagle犬随机分为对照组、模型组、治疗组，每组3只。其中对照组、模型组均在牙损区域放置0.3 g Bio-Oss骨粉+30 μl PBS+Bio-Gide膜覆盖处理，治疗组给予地塞米松喷雾(tid)+0.3 g Bio-Oss骨粉+30 μl DPSCs(107cells/ml)+Bio-Gide膜覆盖处理，每周给药1次，持续12周。给药完成后，采用滤纸条法收集动物龈沟液，于12 000 r/min离心15 min后收集上清液，-20℃保存待测。

1.7 骨高度检测

分别于造模前和药物治疗完成后采用平行透照技术拍摄X线片，取正侧位及局部牙片，观察分析各组Beagle犬种植体近、远中边缘骨高度的变化。

1.8 Elisa实验

采用Elisa试剂盒检测各组Beagle犬龈沟液中TNF-α、IL-1β、IL-6、TGF-β3的含量，整个操作过程严格按照说明书进行，于450 nm处检测，根据标准曲线计算各指标浓度。

1.9 统计学处理

2 结果2.1 DPSCs一般形态学观察及鉴定结果

显微镜下观察显示，DPSCs多数呈圆形、椭圆形，细胞透亮有光泽，细胞间分布较均匀，排列无明显规则；Strol-1、CD146均是DPSCs的特异性标记物，其中Strol-1主要表达于细胞膜，CD146主要表达于胞浆中，免疫荧光染色后，可见特异性荧光在细胞中阳性表达，随机选取5个视野计算阳性细胞率，结果表明DPSCs达85%以上(图1，见彩图页Ⅰ)。

2.2 各组Beagle犬近、远中边缘骨高度比较

与对照组比较，模型组Beagle犬种植体近、远中边缘骨高度均明显下降(P<0.05)；与模型组比较，治疗组近、远中边缘骨高度均明显增加(P<0.05，表1)。

2.3 各组Beagle犬龈沟液炎症因子含量比较

与对照组比较，模型组Beagle犬龈沟液中炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6含量均显著上升(P<0.01或P<0.05)；与模型组比较，治疗组Beagle犬龈沟液中TNF-α、IL-1β、IL-6含量均显著下降(P<0.01或P<0.05)，其中以TNF-α下降最为明显(P<0.01，表2)。

GroupNear-middle marginal bone densityDistal marginal bone density Before treatmentAfter treatmentBefore treatmentAfter treatmentControl2.76±0.622.75±0.512.82±0.562.82±0.50Model2.75±0.712.35±0.84∗2.83±0.65 2.51±0.46∗Treatment2.75±0.752.62±0.42#2.84±0.59 2.70±0.61#

*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsmodel

GroupTNF-αIL-1βIL-6Control53.21±8.1235.54±7.5232.21±7.01Model77.22±11.20∗∗61.41±8.13∗∗ 50.14±8.24∗Treatment58.18±7.52## 46.17±8.68# 41.22±6.88#

*P<0.05,**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsmodel

2.4 各组Beagle犬龈沟液TGF-β3含量比较

与对照组比较，模型组Beagle犬龈沟液中TGF-β3含量显著下降(P<0.01)；而在给予地塞米松联合DPSCs治疗后，龈沟液中TGF-β3含量明显回升(P<0.01，表3)。

GroupTGF-β3Control284.87±55.63Model198.84±52.91∗∗Treatment253.67±63.91##

**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsmodel

3 讨论

糖尿病已成为种植体周围炎的关键危险因素之一。研究表明，糖尿病状态下持续高血糖易损害正常的骨代谢，影响口腔种植患者种植体骨结合，并激活周围促炎性因子，导致种植体周围炎的发生[6]。位于牙髓组织中的DPSCs是具有高度分化能力的成体干细胞，能向软骨细胞、骨细胞、神经细胞等分化，在牙体修复、种植再生方面具有重要的应用前景[7]。本研究以糖尿病种植体周围炎Beagle犬为研究载体，经地塞米松喷雾联合犬来源的DPSCs治疗12周后，通过评价牙区骨高度及龈沟液中炎症因子及TGF-β3的含量，旨在探讨DPSCs的潜在疗效机制。

Beagle犬是一种常用的非啮齿类实验动物，具有易饲养、性格温顺、价格经济等优势，由于其牙槽骨形态、骨密度与人接近，通常作为口腔动物实验的首选。本实验采用一次性腹腔注射四氧嘧啶的方法建立糖尿病Beagle犬模型，并持续观察4周时间，确定糖尿病模型建立成功后，于拔牙区植入种植体，种植后8周于种植体位点采用菌斑控制法建立种植体周围炎感染模型，通过平行投照X线片分析，确定模型建立成功。龈沟液是由沟内上皮和结合上皮从牙龈结缔组织渗入到龈沟内的液体，其内容物主要由牙周组织释放，对于牙周疾病的临床及实验研究具有重要指导意义[8]。

研究表明，在种植体周围炎病理条件下，龈沟液中炎症因子含量显著上升，严重影响牙骨的恢复并增加感染的风险[9]。TNF-α、IL-1β、IL-6是炎症介导的经典指标，TNF-α主要由活化的T细胞产生，是机体损伤期间最早作出应答的介质之一，可引起并加重机体全身炎症反应；IL-1β、IL-6同属于白细胞介素中促炎性因子，介导炎症发生的重要过程，其水平升高通常预示着感染的发生[10-11]。本研究发现，糖尿病Beagle犬种植体周围炎龈沟液中TNF-α、IL-1β、IL-6含量较对照组均明显上升，炎症现象明显，经地塞米松喷雾联合DPSCs治疗后，炎症程度显著减轻。

TGF-β是一种多功能性生长因子，主要在炎症调节、组织修复、肿瘤侵袭和神经系统等方面发挥作用，参与调节细胞的生长、分化及免疫应答反应[12]。TGF-β主要有三个亚型(TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3)，其中TGF-β3来源于骨质，能促进成骨细胞生长，同时又能抑制破骨细胞的合成，在牙体修复再生中起重要作用[13]。龈沟液中TGF-β3水平能在一定程度上决定牙体种植后的恢复速率[14]。本研究结果显示，模型组Beagle犬龈沟液TGF-β3含量较对照组显著下降，而在给予治疗后其含量明显回升，说明是通过增加TGF-β3水平发挥治疗作用。

综上，本研究发现，地塞米松联合DPSCs治疗对糖尿病种植体周围炎有明显的改善作用，其作用可能与降低炎症反应，增加TGF-β3水平有关，但尚不明确炎症因子的减少是否与TGF-β3水平的升高有直接联系。本研究阐明地塞米松联合DPSCs治疗糖尿病种植体周围炎的部分机制，但其更多潜在的作用机制仍有待进一步研究。