红花水提取液对小鼠系统性硬皮病的防治作用及其机制*

范春芳， 张红霞， 唐逸豪， 徐海环， 宋 冬

(1. 中国人民武装警察部队特色医学中心药剂科， 天津 300162； 2. 中国人民武装警察部队特色医学中心皮肤科， 天津 300162；3. 中国人民武装警察部队特色医学中心， 天津 300162)

系统性硬化病(systemic scleroderma, SSc)属于一种结缔组织病，除皮肤硬化外，伴随微血管病变、皮肤和内脏纤维化是其主要的临床表现，疾病进展伴随免疫系统的异常活化，其中以细胞介导的免疫反应为主。目前，临床上治疗SSc主要是应用糖皮质激素来抑制免疫反应，药物不良反应较多，疗效并不理想[1]。研究表明活血化瘀中药具有抑制胶原纤维过度增生的作用。中药红花具有扩张血管、改善血液循环、抑制成纤维细胞增殖、调节机体免疫功能等作用，药物不良反应少[2-3]。本研究观察了红花对 SSc小鼠的影响，并探讨了相关的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

实验动物，60只6～7周雌性BALB /C小鼠，SPF 级，体质量 18～20 g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，实验动物合格证号：SCXK(京)2016-0011。饲养在20～25℃室温、40%～70%相对湿度的清洁环境中，5只/笼，12 h昼/夜循环照明。注射用盐酸博来霉素(规格：15 mg/瓶，批号：140372，日本化药株式会社)。中药红花(批号：140901，产地:新疆)采用常规方法加水煎煮并浓缩成浓度为1 g生药 /ml的红花水煎液。强的松片(规格:每片5 mg，批号：141123，广东华南药业集团有限公司)。小鼠IL-6、IL-17、CTGF、TGF-β ELISA试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)；HYP试剂盒(南京建成生物工程研究所)。酶标仪(BMG LRBTECH公司)；彩色病理图像分析系统(日本Nikon公司)。

1.2 动物建模、分组及给药

将60只小鼠随机分为对照组、模型组、强的松组、红花低、中、高剂量组，每组10只。参考文献[4-5]方法，将所有小鼠背部中央区部位毛发剃除，面积约2.0 cm × 2.0 cm，使用1 ml一次性无菌注射器在小鼠背部被毛区皮下，对照组小鼠注射100 μl 0.01 mol /L PBS(pH 7.2)，模型组和药物治疗组注射100 μl浓度为 200 μg /ml的注射用盐酸博来霉素，每天1次，连续注射28 d。造模开始后即根据分组进行药物干预，对照组和模型组小鼠给予10 ml/kg生理盐水灌胃，阳性药物强的松组小鼠给予强的松4.5 mg/kg灌胃，红花低、中、高剂量组小鼠分别给予红花1.5、3、6 g/kg灌胃，所有小鼠每天灌胃给药1次，灌胃10 ml/kg体积连续给药28 d。小鼠自由饮食、饮水。

1.3 一般情况观察

实验过程中观察各组小鼠的摄食饮水情况、自主活动情况、毛发、皮肤等一般情况观察。

1.4 血清指标检测

各组小鼠最后一次给药24 h，禁食、不禁水12 h，按3 ml/kg 腹腔注射2% 戊巴比妥钠麻醉，固定，用剪刀剪开胸腹腔，使用1 ml一次性注射器穿刺左心室取血，放入未抗凝管内，37℃静置1～2 h，3 500 r/min离心15 min，取上清，-80℃保存。采用ELISA试剂盒，严格按照试剂盒说明书的要求，检测血清中IL-6、IL-17的含量。

1.5 皮肤指标检测

各组小鼠心脏采血后，处死小鼠，切取背部注射区皮肤6 mm×6 mm大小，一部分加入生理盐水剪碎后研磨成2%组织匀浆，3 000 r/min离心10 min，收集上清液，采用ELISA法检测皮肤组织中因子CTGF、TGF-β含量，采用水解法检测HYP含量；另一部分放入10%甲醛PBS溶液固定，脱水、石蜡包埋后进行4 μm厚切片，按照试剂盒说明书的要求进行HE染色，并采用彩色病理图像分析系统对皮肤厚度进行测量，皮肤厚度包括表皮和真皮层的厚度，每只小鼠的皮肤切片随机取5处测量皮肤厚度，取平均值作为该小鼠的皮肤厚度。

1.6 统计学处理

2 结果

2.1 一般情况

实验过程中各组小鼠没有出现死亡现象。对照组小鼠生长状态良好，反应灵敏；背部注射PBS区皮肤无硬化现象。模型组小鼠自发活动减少，精神状态差；背部注射博来霉素区皮肤与皮下组织粘连，弹性差，显著增厚变硬，毛发未见生长。强的松组、红花治疗组小鼠自发活动相对模型组增加，精神状态良好，背部注射博来霉素区皮肤与皮下组织粘连减轻，皮肤变薄，弹性变大，毛发出现不同程度的生长。

2.2 各组小鼠皮肤真皮厚度

与对照组比较，模型组小鼠皮肤真皮厚度明显升高；与模型组比较，强的松组和红花低、中、高剂量组小鼠皮肤真皮厚度明显降低(P<0.05，表1)。

Tab. 1 Comparison of CTGF, TGF-β, HYP in skin n=10)

*P<0.05，**P<0.01vscontrol group；#P<0.05，##P<0.01vsmodel group；△P<0.05，△△P<0.01vsprednisone group；▲P<0.05，▲▲P<0.01vssafflower 1.5 g/kg group；○○P<0.01vssafflower 3 g/kg group

2.3 各组小鼠皮肤组织CTGF、TGF-β、HYP含量

与对照组比较，模型组小鼠皮肤组织CTGF、TGF-β、HYP含量均明显升高；与模型组比较，强的松组和红花低、中、高剂量组小鼠皮肤组织CTGF、TGF-β、HYP水平均明显降低；与强的松组比较，红花低、中、高剂量组CTGF含量和低、中剂量组HYP含量均明显增加。红花中、高剂量组CTGF、TGF-β含量和高剂量组HYP含量均较低剂量组明显降低；红花高剂量组CTGF较中剂量组明显降低(P< 0.05，表1)。

2.4 各组小鼠血清 IL-6、IL-17水平

与对照组比较，模型组小鼠血清IL-6、IL-17水平均明显升高；与模型组比较，强的松组和红花低、中、高剂量组小鼠血清IL-6、IL-17水平均明显降低；与强的松组比较，红花中、高剂量组小鼠血清IL-17水平均明显降低；红花中、高剂量组小鼠血清IL-6、IL-17水平均较低剂量组明显降低，红花高剂量组小鼠血清IL-17水平较中剂量组明显降低(P<0.05，表 2)。

GroupIL-6IL-17Control7.86±1.2418.85±3.51Model16.38±2.34∗∗95.04±8.85∗∗Prednisone12.39±1.52##61.72±7.51##Safflower 1.5 g/kg13.68±2.01#68.17±4.28##ΔSafflower 3 g/kg12.07±1.52##▲49.90±6.29##ΔΔ▲▲Safflower 6 g/kg11.23±2.16##▲40.96±7.79##ΔΔ▲▲○○

*P<0.05，**P<0.01vscontrol group；#P<0.05，##P< 0.01vsmodel group；△P<0.05，△△P<0.01vsprednisone group；▲P<0.05，▲▲P<0.01vssafflower 1.5 g/kg group；

○○P<0.01vssafflower 3 g/kg group

3 讨论

SSc 是一种慢性自身免疫性疾病，其发病机制主要涉及成纤维细胞活化、微血管病变、免疫系统异常三个方面，皮肤纤维化为其主要临床表现。在病变组织中T淋巴细胞活化、增殖，炎症反应增强，刺激成纤维细胞增殖、胶原增加，导致组织纤维化。IL-6是一种促炎、促纤维化的细胞因子，是T细胞诱导炎症反应的早期始动因素，与TGF-β一起诱导初始T细胞分化为CD4+T细胞亚型即Th17细胞，能够分泌具有强大的致炎作用的IL-17，又可以通过诱导、活化 T细胞、产生IL-6等多种炎性介质，增强炎症反应。IL-6、IL-17 参与刺激成纤维细胞增生，导致组织纤维化[6]。

博来霉素是碱性糖肽类抗癌抗生素，能够产生活性氧，诱导组织纤维化的形成。本研究选用BALB /C小鼠，同通过皮下注射盐酸博来霉素建立SSc 模型，并采用水解法检测皮肤组织HYP的含量来反映胶原水平，结果显示小鼠真皮厚度增加、HYP 含量增加，说明成功建立SSc小鼠模型；血清IL-6、IL-17水平升高，说明皮肤组织炎症反应促进SSc的发生。

结缔组织生长因子(connective tissue growth factor，CTGF)、转化生长因子(transforming growth factpr-β，TGF-β)与SSc发病机制密切相关。SSc典型的临床表现是皮肤增厚、纤维化，皮肤中CTGF mRNA表达显著增高。TGF-β作为重要的促纤维化细胞因子，可直接促进成纤维细胞增殖、胶原基因的转录及表达。SSc患者成纤维细胞处于一种永久激活状态，部分是受自分泌和旁分泌的CTGF和TGF-β的影响，拮抗CTGF和TGF-β可以防治纤维化，发挥治疗SSc的作用。实验结果表明，中药红花可以降低 BALB/C硬皮病小鼠皮肤组织中CTGF与TGF-β的含量，从而发挥防治皮肤纤维化的作用。红花水煎液可改善血管通透性，减少血浆蛋白外渗，抑制巨噬细胞产生纤维化关键因子如结缔组织生长因子(CTGF)、转化生长因子(TGF-β)等，从而减少成纤维细胞增殖和黏附和Ⅰ、Ⅲ型胶原合成及ECM沉积，抑制皮肤硬化[3]。

SSc尚无特效治疗药物，糖皮质激素具有免疫抑制作用，是目前临床上SSc治疗性价比最高的药物[7]。但糖皮质激素治疗SSc 的效果并不十分显著，不宜长期使用，肢端型硬皮病、肺纤维化、肾损害患者禁用[8]。中药红花具有广泛的药理作用，能够改善心脑血氧供应减轻缺血性损伤，抗氧化、抗纤维化、免疫调节等作用，临床上多用于心血管系统、免疫系统等疾病的治疗[9]。红花水煎液能抑制Th17细胞分化，减少IL-17分泌，从而抑制免疫炎症反应而具有抗皮肤纤维化的治疗作用；红花组真皮厚度的降低还可能与红花抗氧化、清除氧自由基、改善血管微循环等多靶点、多环节的作用有关[10]。

本研究建立SSc小鼠模型，红花进行干预，同时选择强的松作为阳性对照药物，结果显示红花治疗组、强的松组真皮厚度、皮肤组织HYP含量均降低，提示两种药物均可改善SSc小鼠皮肤纤维化。红花治疗组、强的松组皮肤组织CTGF、TGF-β含量及血清 IL-6、IL-17 水平均较模型组下降，说明两种药物均能减轻免疫炎症，抑制组织纤维化的形成。综上所述，红花可改善 SSc 小鼠皮肤组织纤维化，降低皮肤组织CTGF、TGF-β、HYP含量及血清 IL-6、IL-17 水平可能是其作用机制之一。补充说明红花水提取液的作用与阳性对照的优劣及红花水提取液的最佳剂量。