异硫氰酸苄酯纳米乳液射流空化制备与冻融稳定性研究

田 甜 周 艳 高 悦 李 杨,2 王中江 李 良

(1.东北农业大学食品学院， 哈尔滨 150030; 2.哈尔滨食品产业研究院， 哈尔滨 150028)

0 引言

异硫氰酸苄酯(BITC)是蔬菜抗癌作用的主要生物活性物质[1]。文献[2]的流行病学研究表明，BITC可以作为有效的抗菌剂，并作为传统抗生素更安全、更有效的替代品。因为BITC具有强烈的挥发性、易降解、水溶性差、生物利用度低等缺点，目前缺乏适当的补充机制[3]。

纳米乳液是指粒径在20～500 nm之间的一种营养物运输体系。与一般乳液相比，纳米乳液对体系的物理化学稳定性和所运载营养物质的体内吸收起到增强效果[4]。吐温、司盘等小分子表面活性剂可作为纳米乳液乳化剂，但其存在一定安全隐患，目前大多使用天然表面活性剂作为乳化剂，其中大豆分离蛋白因其高营养价值及较高的乳化性而被广泛应用于食品加工中[5-6]。大豆分离蛋白受其结构影响，其乳化性等功能性质不能满足纳米乳液制备要求，因此加入磷脂酰胆碱，以增强其乳化性。同时，利用射流空化技术产生的空穴效应使蛋白的柔性结构及二级结构发生变化，降低乳液的粒径，提高乳液的稳定性[5]。射流空化是一种新型加工技术，利用液体在U型管中快速流动并形成静脉收缩，使附近压力下降，形成数百万个空腔，随着液体膨胀，压力恢复导致空腔坍塌，以高幅度压力脉冲释放能量，得到储藏稳定性高、粒径小、易于被人体吸收的乳液。与一般高能乳化方法相比，它是产生空化作用力最便宜和最节能的方法之一，且用于产生空化的设备很简单，系统规模扩大相对容易[7]。

纳米乳液通常通过冷冻保存，可以有效限制微生物生长和化学降解反应[8]。然而，许多乳液在冷冻时非常不稳定，解冻时易造成营养物质分解[8-9]。文献[10]研究发现，超高压均质能显著增强纳米乳液冻融稳定性；文献[11]利用高压均质改变大豆蛋白二级结构，继而增加其与葡聚糖的交联作用，改善了纳米乳液的冻融稳定性。

本文以大豆蛋白-磷脂作为表面活性剂，以BITC与大豆油混合物作为油相，采用射流空化技术制备纳米乳液，探究射流空化对纳米乳液形成与冻融稳定性的影响，以期为工业生产提供理论支撑，扩大其在食品行业的应用。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

大豆分离蛋白，山东禹王有限公司；异硫氰酸苄酯(BITC)、磷脂酰胆碱，索莱宝公司；吐温80、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠等化学试剂均为国产分析纯级。

1.2 仪器与设备

ULTRA-TURRAX UTL2000型乳化机，德国IKA仪器设备公司；射流空化机，北京华瑞创世科技有限公司；Zetasizer Nano-ZS 90型粒度分析仪，英国马尔文公司；UV755B型紫外分光光度计，上海菁华科技仪器有限公司；Delta Vision OMX SR型光学显微镜，美国通用电气公司；PerkinElmer DSC8000型差示扫描量热仪，珀金埃尔默企业管理(上海)有限公司；PHSJ-4A型实验室pH计，中国上海雷磁公司；FA2004B型电子分析天平(精度0.000 1 g)，北京赛多利斯仪器系统有限公司。

1.3 方法

1.3.1粗乳液制备

将大豆蛋白(1.5%)和磷脂酰胆碱(0.2%)溶于磷酸盐缓冲液(pH值7.0、0.01 mol/L)中，室温(25℃)下连续搅拌2 h以致完全溶解，然后加入叠氮化钠(0.01 g/(100 mL))以抑制微生物生长，把大豆油(10%)分散到水相中，用高速分散器以转速10 000 r/min均质2 min，形成粗乳液[12]。

1.3.2BITC纳米乳液射流空化制备工艺

将粗乳液通过射流空化机进一步均质乳化即得大豆蛋白-磷脂酰胆碱BITC纳米乳液。分别取1.3.1节制备的适量粗乳液于烧杯中，置于射流空化机中，分别在射流空化压力0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 MPa条件下射流空化处理10 min，以循环冷热水控制射流空化温度，在相应工艺条件下制备BITC纳米乳液[13]。

1.3.3冻融处理

将制备得到的乳液立即进行冻融处理。取不同的乳液样品20 mL装入塑料容器中，在-20℃的冰箱中恒温贮存24 h，将冷冻后的样品在20℃水浴中解冻，取部分样品保持20℃不变并进行分析。再将解冻的乳液置于-20℃冰箱中恒温贮存24 h，进行第2次冻融循环，将冻融过程重复3次，并在每次冻融后测量乳液的冻融稳定性[14]。

1.3.4粒径测量

用Zetasizer Nano-ZS 90型光散射粒度分析仪分别测定经过冻融循环的乳液粒径分布规律。参数设定：BITC油滴的折射率为1.460，水相溶液折射率为1.330，为降低多重光散射效应，分析前用磷酸盐缓冲液(pH值7.1，0.01 mol/L)稀释BITC纳米乳液1 000倍测粒径及PDI(聚合物分散性指数，用于描述聚合物分子量分布)，稀释50倍测ζ-电位[15]。

1.3.5乳层析指数

借鉴文献[16]的方法并略加修改。纳米乳液在每次冻融循环后，分成上下两层。记录乳状液所在具塞比色管底部清液层的高度Hs和乳液的总高度HT。乳液的乳层析指数CI表示为

1.3.6出油率

借鉴文献[17]的方法并略加修改。采用染料稀释法确定冻融后乳液油脂释放量，苏丹Ⅲ油溶液制备：室温下准确称量0.001 5%的苏丹Ⅲ染液与大豆油混合，磁力搅拌12 h，使苏丹Ⅲ完全溶解。以大豆油为空白对照，选择波长为508 nm测定苏丹Ⅲ油溶液的吸光度A1，得到标准曲线。将4 g苏丹Ⅲ油溶液与16 g冻融处理后的乳液样品混合均匀，静置60 min后1 000g离心20 min。用移液枪等量吸取乳状液顶部1.5 mL油状物，在高速离心机15 000g条件下离心20 min。取上清液在508 nm波长处测定吸光度A2，出油率计算公式为

其中a=A1/A2

式中φe——乳状液中脂肪质量分数，%

M0——苏丹Ⅲ染液质量，g

Me——乳状液样品质量，g

1.3.7乳液显微结构

将经过冻融循环的乳液匀速搅拌30 s，使其保持均匀，吸取20 μL BITC纳米乳液滴于载玻片中心，盖上盖玻片，注意不要产生气泡，将载玻片置于载物台上观察，先在10倍物镜下找到清晰的视野，然后在40倍物镜下放大40×40倍率进行乳液液滴外貌观察。

图1 冻融后射流空化压力对纳米乳液平均粒径和PDI的影响Fig.1 Effect of jet-cavitation pressure of different jets on average particle size and PDI of nanoemulsion after freeze-thaw

1.3.8差示扫描量热法(DSC)

每个乳液样品制备完成后立即用移液器移取，用电子分析天平准确称量5～10 mg至TAQ20型液体铝坩埚，然后盖上配套的铝盖压盘密封，样品盘放置在DSC炉腔外侧电极，内侧放置相同质量的磷酸盐缓冲溶液的密封铝盘作对照。热分析通过双循环模型进行，扫描范围为-40～40℃，10℃/min，氮气流速25 mL/min，每个乳液样品至少作两次平行重复试验，测得的DSC数据包括结晶或融化过程的起止温度、顶点温度和热焓变(DH)[18]。

1.4 统计分析

所有试验重复3次取平均值，结果表示为平均值±标准差。采用SPSS 20.0进行数据处理和分析，使用Origin 9.0软件制图。

2 结果与分析

2.1 平均粒径和PDI

平均粒径是衡量纳米乳液稳定性的关键指标，一般来说，乳液的液滴平均粒径越小，乳液越稳定[19]，PDI表征聚合物分子量分布，PDI值越小，说明乳液体系中粒径分布越均匀，液滴分散性越好[20]。冻融循环对乳液液滴平均粒径和PDI的影响如图1所示。随着射流空化压力的增大，乳液平均粒径及PDI呈显著下降趋势，经过3次冻融循环后纳米乳液粒径及PDI显著增大，未经射流空化处理的乳液冻融稳定性最差，第2次冻融后乳液出现絮凝现象，这是由于冷冻处理使溶液形成不规则冰晶，易刺穿液滴界面膜，小油滴很容易从界面层渗透出来接触聚结成大油滴，破坏乳液的冻融稳定性[21]。当压力增至0.8 MPa时，冻融循环对纳米乳液粒径((252±6.2) nm)及PDI值(0.114±0.034)影响显著减小，乳液冻融稳定性最强，这是因为射流空化产生的压力提高了蛋白表面的离子集团数和蛋白的水合力，提高了蛋白-磷脂乳化体系的稳定性，而且射流空化处理增加了蛋白的乳化性能，能够在油滴表面快速形成更加致密的界面膜，使乳液在冷冻条件下形成的脂肪晶体或冰晶很难破坏界面膜，有效减少了油滴之间的聚集和凝结现象产生，这与文献[22]研究结果一致。且随着射流空化压力的继续增加，乳液稳定性降低，这是由于过高压力可能导致乳液液滴裂解而出现油-水界面失稳现象，表现为平均粒径升高。文献[23]研究发现，均质压力过高会导致大豆蛋白相对分子质量变大， 这也可能是粒径及PDI 增大的原因。

2.2 ζ-电位

乳液的表面电荷密度能有效反映液滴之间的静电相互作用，ζ-电位绝对值越高乳液越稳定。如图2所示，纳米乳液具有相对高的负表面电位，这可归因于溶液pH值高于吸附的大豆蛋白的等电点[24]。在pH值7.0的缓冲溶液中，未经射流空化处理的纳米乳液ζ-电位为-12.45 mV，随着射流空化压力增加，乳液整体电位绝对值呈现先升高后降低的趋势，经0.8 MPa射流空化处理的纳米乳液ζ-电位为(-27.2±0.6) mV，表面电荷密度最大。结合乳液粒径和微观结构分析，此时乳液的稳定性最好，这是因为射流空化改变乳液中蛋白质-磷脂复合物的组成和结构，使乳液界面性质发生改变，间接增加了乳液的表面电荷[24]。文献[25]研究发现，空化处理使大豆分离蛋白的二级结构发生改变，蛋白质结构伸展进而促进其与磷脂之间的相互结合，造成乳液表面电荷的增加，同时磷脂增加蛋白质的乳化效率，减少界面层的解析现象，使乳液的稳定性进一步提高。经冻融循环后乳液的电位绝对值都有所下降，冻融稳定性也显著降低，这是因为冻融处理使蛋白分子从乳液中解析，蛋白质的乳化效率下降，同时冻融处理使乳液表面电荷减少导致油滴之间相互排斥形成聚集[26]。

图2 冻融后射流空化压力对纳米乳液ζ-电位的影响Fig.2 Effect of different jet-cavitation pressure on ζ-potential of nanoemulsion after freeze-thaw

2.3 乳液显微结构

光学显微镜可以直观地表征乳液颗粒大小、分散状况及冻融处理产生的不稳定现象。由图3可知，由射流空化处理的样品均具有纳米尺寸的球状液滴，乳液经第1次冻融后，纳米乳液冻融稳定性变差，乳液液滴大小不均且出现聚集现象，3次冻融后乳滴成片聚集，这是由于乳液冷冻过程中部分未形成冰晶的液相相互聚集，且冷冻处理使大豆蛋白结构变性，蛋白乳化性等功能性质降低，油-水界面膜强度减弱，加剧了油滴之间的聚集。随着射流空化压力增加，大豆蛋白与磷脂形成的复合乳液粒径较小，文献[27]研究发现，超高压均质产生的高速剪切作用力能显著降低乳液粒径直径，并增强乳液的溶解度。当射流空化处理压力为0.8 MPa时，液滴粒径最小且分布均匀，表面活性剂完全覆盖油滴表面，乳液冻融稳定性增强，这是因为射流空化使大豆蛋白柔性结构发生改变，蛋白-磷脂结构更为致密，不易被油晶和冰晶破坏。空化压力过大时，蛋白-蛋白、蛋白-磷脂之间的交联程度过高，大豆蛋白乳化能力下降，乳液体系油体积面积增大，显微镜呈现相对较大的颗粒[28]。

图3 冻融后射流空化压力对纳米乳液显微结构的影响Fig.3 Effect of jet-cavitation pressure on microstructure of nanoemulsion after freeze-thaw

2.4 乳层析指数

通过测定乳状液的乳层析指数反映乳状液的稳定性，如图4所示，乳液经冻融处理后，乳层析指数增加，是因为冷冻使乳液中的水分和油脂形成晶体，刺破油脂表面较薄的界面膜，小分子油滴聚集成大分子油滴，且随着冻融次数增多，乳液的聚集程度更显著。较未处理乳液相比，乳液的乳层析指数随着射流空化压力的增加而降低，其中射流空化压力为0.8 MPa的纳米乳液乳层析指数比未处理样品的乳层析指数降低了51.39%。这可能是由于射流空化处理产生的超高速剪切力及空化作用力改变了蛋白质的柔性结构，表面电荷增多进而稳定性提高，也有可能是射流空化处理使蛋白质表面疏水基团暴露，使其更易吸附在油滴表面抵抗冷冻对界面稳定性的破坏[29]。

图4 冻融后射流空化压力对纳米乳液乳层析指数的影响Fig.4 Effect of jet-cavitation pressure on emulsion index of nanoemulsion after freeze-thaw

2.5 出油率

由表1可知射流空化处理及冻融循环对大豆蛋白-磷脂乳状液出油率的影响。随着冻融次数增多，乳状液的出油率增大，乳液的冻融稳定性逐渐降低，这是因为乳液冷冻过程中形成冰晶，界面膜遭到破坏，小分子油滴逐渐聚集，且冷冻处理使大豆蛋白过度交联，蛋白乳化能力下降，与磷脂之间的相互作用降低导致乳液界面强度下降。随着射流空化处理压力增加，乳液的出油率呈显著下降趋势(P<0.05)，当射流压力增加至0.8 MPa时，乳液出油率较未处理样品下降83.64%，乳液呈现较好的冻融稳定性，这是因为空化处理提高了蛋白质的乳化性能，蛋白的界面吸附能力得到改善，增强了界面强度。文献[30]利用超声提高大豆分离蛋白乳化性，文献[31]发现高压均质对豆类蛋白质乳化活性和乳化稳定性具有改善作用。但当射流空化处理压力过大，交联程度过高时，蛋白质乳化能力下降，油滴从界面膜内解析出来与其他物质混合形成聚集，乳液的出油率略有增长。

表1 冻融后射流空化压力对纳米乳液出油率的影响Tab.1 Effect of jet-cavitation pressure on oil yield of nanoemulsion after freeze-thaw %

注：同列不同字母表示差异显著(P<0.05)。

2.6 差示扫描量热分析

通过差示扫描量热法(DSC)可以研究乳液油、水结晶对冻融稳定性的影响，在一定条件下，乳液体系可能有一相出现结晶，也可能两相均出现结晶，这取决于水、油两相凝固点。研究发现大豆油的凝固点约为-17℃，SPI凝固点约为-16.5℃，水相和油相凝固点均高于试验冷冻温度(-20℃)，图5显示了乳液冻融的热谱图，在冷冻过程中，乳液出现结晶峰，凝固点在-19.3～-18.7℃之间，表明在-20℃冷冻条件下，未处理乳液及射流空化乳液均形成结晶，所以纳米乳液冻融稳定性差是由冷冻过程中冰晶破坏乳液界面平衡造成的。未处理乳液冻融过程中，其在 6℃左右会观察到一个比较明显的放热峰，这表明乳液中存在游离脂肪，原因是由于油滴刺破界面膜形成聚集[32]，而射流空化处理的乳液在6℃左右出现较缓的放热峰，随着空化压力增加，放热峰变缓，这说明射流空化能显著改善冻融处理对乳液稳定性的影响。

图5 冻融后射流空化压力对纳米乳液DSC的影响Fig.5 Effect of jet-cavitation pressure on nanoemulsion DSC after freeze-thaw

3 结束语

射流空化对大豆分离蛋白-磷脂的改性可以提高其乳液体系的冻融稳定性。经过3次冻融后，经射流空化的纳米乳液冻融稳定性显著高于未处理乳液。当射流空化压力为0.8 MPa时，乳层析指数和出油率分别比未处理乳液降低了51.39%、83.64%，相较于传统大豆分离蛋白乳化体系，经射流空化处理的乳液冻融稳定性得到很大提高。射流空化技术产生的高速剪切力会改变大豆分离蛋白柔性结构，使其与磷脂更好地交联，形成坚韧的界面膜，减弱冻融作用对乳液热特性的影响，乳液在3次冻融后蛋白没有明显的桥联絮凝现象，油滴依然被紧密地包裹在界面膜中，表现出较好的冻融稳定性。