犬腺病毒I 型和II 型TaqMan 双重荧光定量PCR 方法的建立

巨敏莹，王艳杰，刘东霞，张 斌，韩 宇，乌吉斯古楞，宋庆庆，关平原

（1.内蒙古农业大学兽医学院，内蒙古呼和浩特 010018；2.金宇保灵生物药品有限公司，兽用疫苗国家工程实验室，内蒙古呼和浩特 010020）

犬腺病毒（canine adenovirus，CAV）又称犬传染性肝炎病毒，其基因组为双股DNA。犬腺病毒病是对包括犬在内多种哺乳动物的一种致病性强、感染范围广、高度接触性传染病[1-2]。CAV 有两个血清型：CAV-I 型和CAV-II 型。CAV-I 型是传染性犬肝炎的病原体，引起的特征性病症为肝小叶坏死、肝实质和内皮细胞核包涵体[3-4]，以急性坏死性肝炎为特征，恢复期病犬角膜由浑浊逐渐变为蓝白色，因此又称犬的“蓝眼病”[5]。CAV-II 型是传染性气管支气管炎的病因之一，可引起犬轻度急性上呼吸道疾病，患病率很高[6]。在感染细胞的核内，CAV-II 排列紧密，呈典型的结晶状；而CAV-I排列相对疏松，有时也能呈现紧凑排列，但其所形成的结晶不如CAV-II 明显[7]。

CAV-I 和CAV-II 型的共感染频率较高，在同一份病料中经常可检测到两种CAV 病毒。但因两种病毒之间存在交叉反应，导致血清学方法在诊断中的应用有限[8]，因此需要建立一种特异性强、敏感性高的CAV-I 型和CAV-II 型鉴别检测方法。本试验建立了用于鉴别检测CAV-I 和CAV-II 的TaqMan 双重荧光定量PCR。该方法操作简便、特异性强、敏感性高、重复性好。

1 材料与方法

1.1 样品来源和主要试剂

CAV-I 型、CAV-II 型病毒以及犬瘟热病毒（CDV）、犬副流感病毒（CPIV）、犬细小病毒（CPV）、犬冠状病毒（CCV），均由金宇保灵生物药品有限公司兽用疫苗国家工程实验室提供。

Axyprep 体液病毒DNA/RNA 提取试剂盒，购 于AxyGen 公 司；AceQ®QPCR Probe Master Mix 试剂（批号L/N7E241E8），购于Vazyme 公司；E.COLI JM109 感受态细胞、SOC Medium、MiniBEST Agarose GelDNA Extration Kit Ver 4.0（批号AI10973A），购自Takara 公司；TOPO TA Clong® kit for sequencing PCR®4-TOPO® vector，购 自invitrogen 公 司；Scientific Gene JET Plasmid Miniprep kit ck0502（批 号00532991），购 自Thermo 公司。

1.2 引物和探针设计

依据GenBank 中已登录的CAV I 型和II 型基因序列（CAV-I 型GenBank 号KP840549.1，CAVII 型GenBank 号EU717145.1），利用DNAstar 软件中的MegAlign 模块进行序列分析并设计引物，设计1 对符合两种病毒的通用引物，以及2 条标记不同发光基团能够区分两种基因型的探针（表1）。引物探针由上海生工有限公司合成。

表1 CAV-I 和CAV-II TaqMan 双重荧光定量PCR 引物和探针

1.3 病毒核酸提取

参照Axyprep 体液病毒DNA/RNA 提取试剂盒说明书，提取CAV-I、CAV-II、CDV、CPIV、CPV、CCV 的病毒DNA 或RNA，将提取的核酸样品置于-20 ℃冰箱保存待用。

1.4 质粒标准品制备

分别以CAV-I 和CAV-II 型病毒为模板，参照如下反应体系（表2，总体积25 μL）和循环条件（表3）进行PCR 扩增，以获得目的片段。将PCR 目的片段胶回收纯化克隆至TOPO 载体中，重组质粒转化至E.coliJM109 感受态细胞，经菌液鉴定和测序，筛选阳性克隆，扩大培养后提取质粒；将提取的质粒用Qubit 3.0 进行质粒浓度测定，并根据拷贝数计算公式计算拷贝数，然后进行10 倍梯度稀释，获得8 个梯度标准品（108～101copies/μL）。CAV-I 型 和CAV-II 型 各个梯度标准品按照1:1 比例混匀，制备CAV-I 和CAV-II 混合标准品。

表2 CAV-I 和CAV-II 标准品制备PCR 反应体系

表3 CAV-I 和CAV-II 标准品制备PCR 反应程序

1.5 方法建立及条件优化

采用25 μL 反应体系，利用方阵法，对CAV-I 型和CAV-II 型TaqMan 双重荧光定量PCR方法的引物浓度（100～500 nm），探针浓度（100～500 nm），模板加入量（1～5 μL）、退火温度（52、54、56、58、60 ℃）等进行优化，以获得最佳反应体系和循环条件。

1.6 标准曲线建立及敏感性试验

将CAV-I 和CAV-II 混匀重组质粒标准品（108～101copies/μL），采用本研究建立的TaqMan双重荧光定量PCR 方法进行扩增，通过Bio-Rad CFX 96 荧光定量PCR 仪及软件生成标准曲线，并对该方法进行敏感度检测。

1.7 特异性试验

采用建立的TaqMan 双重荧光定量PCR 方法，对CAV-I、CAV-II、CDV、CPIV、CPV、CCV 等病毒核酸进行检测，同时设立阴性对照，判定该方法的特异性。

1.8 重复性试验

3 人配3 组体系，采用本研究建立的TaqMan双重荧光定量PCR 方法进行PCR 扩增，计算组内和组间变异系数，分析方法的重复性。

1.9 临床样品检测

将收集的41 份通过人工攻毒取得犬组织和拭子样品进行基因组DNA/RNA 提取，以待检样品为模板，采用建立的TaqMan 双重荧光定量PCR 检测方法和普通PCR 检测方法进行样品检测，并对检测结果进行符合率分析。

2 结果

2.1 质粒标准品制备

以CAV-I 和CAV-II DNA 为模板，利用设计好的引物对其进行扩增，获得预期大小的目的片段。目的片段进行切胶回收纯化后克隆于TOPO 载体，构建的CAV-I 重组质粒浓度为76.5 ng/μL（1.7×1010copies/μL），CAV-II重组质粒浓度为66 ng/μL（1.4×1010copies/μL）。以I 型和II 型稀释后的等比例体积混合模板作为双重荧光定量PCR 的标准品模板。

2.2 反应体系和条件优化

优化后的反应体系如表4 所示（总体积25 μL），循环条件如表5 所示。

2.3 标准曲线建立

采用已建立的CAV-I 和CAV-IITaqMan 双重荧光定量PCR 的反应体系和循环条件进行荧光定量PCR 检测。结果（图1 和图2）显示：CAV-I 和CAV-II 相关系数分别为0.998 和0.999，效率分别为101.2 和100.0，均在 90%～110%之间，具有良好的线性关系；CAV-I 和CAV-II 的回归方程分别为y=-3.293x+42.809 和y=-3.321x+41.490。因此，可以根据所检测临床样品的Cq 值，并参照标准曲线对临床样品进行检测。

表4 反应体系优化结果

表5 循环条件优化结果

图1 CAV-I 和CAV-II TaqMan 双重荧光定量PCR 曲线

图2 CAV-I 和CAV-II TaqMan 双重荧光定量PCR 法标准曲线

2.4 敏感性试验

采用已建立的CAV-I 和CAV-IITaqMan 双重荧光定量PCR 的反应体系和循环条件进行灵敏度验证，发现CAV-I 和CAV-II 最小检测量分别为100 copies/μL 和10 copies/μL（图3），表明所建立方法的敏感性高。

2.5 特异性试验

图3 CAV-I 和CAV-II TaqMan 双重荧光定量PCR 探针敏感度检测结果曲线

采用已建立的CAV-I 和CAV-IITaqMan 双重荧光定量PCR 反应体系和循环条件进行相关病毒核酸检测，每个样品做2 个重复，并设立阴性对照和CAV I 和II 型阳性对照（每个样品2 个重复）。特异性结果显示，仅CAV-I 和CAV-II 核酸出现典型的“S”扩增曲线，且CT 值均小于35，而其他病毒核酸样品和阴性对照均没有出现扩增曲线（图4），表明所建立方法具有较好的特异性。

2.6 重复性试验

采用已建立的CAV-I 和CAV-IITaqMan 双重荧光定量PCR 反应体系和循环条件进行方法重复性验证，发现其组内和组间变异系数均小于5%（表6），表明该方法具有较好的重复性。

2.7 临床样品检测结果

图4 CAV-I 和CAV-II TaqMan 双重荧光定量PCR 特异性检测结果

表6 重复性试验结果

采用已建立的CAV-I 和CAV-IITaqMan 双重荧光定量PCR 反应体系和循环条件，对从人工模型攻毒犬采集到的41 份样品进行检测，同时采用普通方法进行符合率分析。结果（表7）显示：普通方法检出25 份阳性，其中CAV-I 型19 份（阳性率46.3%），CAV-II 型 6 份（阳性率14.6%）；本研究建立方法检出27 份阳性，其中CAV-I 型20 份（阳性率48.7 %），CAV-II 型7 份（阳性率17.1 %）。两种方法总符合率为95.12%。

表7 两种方法检测结果比较

3 讨论

随着人们生活水平的提高，犬与人类的接触变得更加频繁和密切，因此犬健康也得到人们极大重视。CAV 除可感染犬和狐外，还可感染狼、黑熊、臭鼬、豚鼠、大熊猫、银狐、北银狐以及虎等[9-11]。普通人群中的CAV 感染抗体阳性率较高（35%），兽医人员更高（49%）；人感染此病虽不表现症状，但存在隐性感染的风险[12]。病犬和带毒犬是本病主要的传染源，通常痊愈犬排毒期长达180～270 d。本病既可间接传播，也可垂直传播，给犬业发展以及其他动物养殖造成巨大损失。随着分子生物学发展，我国研究者已经对犬CAV-I 和CAV-II 病毒进行了分离鉴定，并且能够通过普通PCR 方法对该病毒进行检测，但本研究建立TaqMan 双重荧光定量PCR 方法可实现快速定量检测。

临床样本检测中，TaqMan 双重荧光定量PCR 方法检测结果准确，与已知病毒类型相符合，表明建立的TaqMan 双重荧光定量PCR 方法可靠性高。与薛向红等[13]建立的CAV-I 型SYBR Green 方法相比较，二重荧光定量方法能同时检测到CAV 的两种基因型，因而节省了检测时间；与Balboni Andrea 等[14]建 立 的CAV I 型 和II 型SYBR Green 实时荧光定量方法相比较，本试验建立方法更加直观具体。与普通PCR 方法相比较，本试验建立的TaqMan 双重荧光定量PCR 方法不仅省时、省力，而且可以同时快速区分I 型和II 型，这为CAV 感染的检测以及流行病学调查提供了便捷快速的方法。