2型糖尿病患者外周血单个核细胞中miR-375的表达及调控研究

温晓静，钟磊，钟宏文

(1.赣州市赣县区人民医院检验科，江西 赣州341100；2.赣州市人民医院检验科，江西 赣州 341000)

2型糖尿病 (T2DM)有更明显的遗传基础，发病多见于成年人而非青少年、发病机制主要为胰岛素抵抗、胰岛素分泌缺陷和非胰岛β细胞自身免疫破坏。虽2型糖尿病具有遗传异质性，但大多数伴2型糖尿病和空腹高血糖的患者特征性表现为胰岛素抵抗、胰岛素分泌障碍和肝脏葡萄糖产生增加等[1-4]。miRNA作为天然的基因调控因子在肿瘤发生、血管生成、细胞分化、胚胎发育等许多重要的病理生理过程中发挥着重要的调控作用[4-5]。大量研究表明异常表达的miRNA与许多疾病的发生发展存在潜在的联系，miRNA有可能运用于疾病的早期诊断及治疗靶点[6-7]。miRNA-375是胰岛组织特异表达的miRNA，能影响胰岛β细胞的胰岛生物合成素的分泌过程[8]。本研究选取初诊的2型糖尿病患者和健康对照者外周抗凝全血，检测miRNA-375的表达情况，并在体外培养细胞，进一步探讨其表达调控机制，期盼为揭示2型糖尿病的发病机制提供新线索。

1 材料与方法

1.1 研究对象 选择2015年1月-2016年12月在我院内科确诊为T2DM的患者为研究对象。收集全血标本共计20例。其中男性12例，女性8例；年龄38～76岁，平均52.4岁；对照组为20例健康体检者。标本收集均通过医院伦理委员会批准并签署了知情同意书。

1.2 主要试剂和仪器 Ficoll分离液购自广州蓝吉生物技术有限公司，miRcute miRNA提取分离试剂盒、miRcute miRNA荧光定量检测试剂盒均购自北京天根生化科技有限公司、miRcute miRNA cDNA第一链合成试剂盒、DMEM/F12培养基购自Hyclone公司、RIPA细胞裂解液北京塞默飞生物科技有限公司 、BCA蛋白浓度测定试剂盒购自北京博奥森生物技术有限公司、实时定量PCR仪购自美国ABI公司。

1.3 细胞培养 HT29细胞株购自广州蓝吉生物科技有限公司。细胞培养体系：DMEM/F12培养液含10%新生牛血清，置37℃、5%CO2培养箱，每2～3 d用0.25%胰蛋白酶消化传代培养。选用对数生长期、台盼蓝拒染率＞95%的细胞用于后续实验。

1.4 生物信息分析 运用生物学信息软件targetscan7.0预测miR-375调控的靶基因。

1.5 RT-PCR检测 采取TRizol试剂提取 RNA，采用M-MLV逆转录酶逆转录为 cDNA，作为 PCR反应的模板。反应体系：cDNA 5.0 μl，上游引物0.5μl， 下游引物 0.5μl，2x SYBR Green qPCR SuperMix 15μl，dH2O 4.0 μl， 总体积 25 μl。 反应条件 ：55℃ 2min；94℃ 2min； 94℃ 15s，56℃ 32s 读板，35 cycles；融解曲线分析：温度 56℃，94℃，每个样重复3次。PRKD1引物序列：上游引物(5’AATGCAGCTTTCATGTATCCACCA3’)，下 游 引 物(5’-GCATTCCAGCTCTCGCAAATCTA-3’)；U6 上 游 引物(5’-CTCGCTTCGGCAGCACA3’)，下游引物(5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’)。 GAPDH 上游引物(5’CCACCCATGGCAAATTCCATGGCA-3’),下游引 物 (5’TCTAGACGGCAGGTCAGGTCCAC-3’)；miR-375上游引物 (5’-AATGCAGCTTTCATGTATCCACCA-3’)， 下游引物 (5’-TGGTGTCGTGGAGTCG-3’)。以 U6,GAPDH 为内参照，以 2-ΔΔCt法表示相对定量结果。

1.6 Western blot检测 以 1.0×106/孔的密度将人HT29细胞接种12孔培养板，总体积1mL，细胞分为空白对照组和miR-375组，培养48 h，消化收集各组细胞。加入RIPA缓冲液，维持4℃。加入PMSF，冰上孵育 30min，移入离心管 4℃，15min。上清液为细胞裂解液可分装-20℃保存。进行Bradford比色法测定蛋白质浓度，取相同质量的细胞裂解液，并加等体积的2×电泳加样缓冲液，沸水浴中3min，上样电泳(浓缩胶 20mA，分离胶 35mA)。再在电转膜仪转膜(100mA40min)。膜用丽春红染色，胶用考马斯亮蓝染色。加入电化学发光(electrochemiluminescence，ECL)试剂，显影。 BI-2000 型图像分析软件分析积分光密度，以GAPDH作为内参。

1.7 双荧光报告基因载体的构建 实验分组：空白组(control,单加细胞)，hsa-miR-375 组(hsa-miR-375模拟物，20μmol/L),hsa-miR-375抑制剂组(inhibitor组,20μmol/L)；阴性对照组(NC，negative control,20μmol/L)，NC inhibitor组(negative control inhibitor，20μmol/L)。

以人外周血单个核细胞的DNA为模板扩增PRKD1 的 3’UTR 序列，并引入 XhoI、Not I酶切位点及保护碱基。PCR产物胶回收后克隆到psiCHECK-2质粒海肾荧光素酶基因的下游，重组载体命名为 psiCHECK-2-PRKD1-3’UTR。 对psiCHECK-2-PRKD1-3’UTR重组质粒 “种子区”的碱基进行定点突变，突变后的质粒为psiCHECK-2-PRKD1-3’UTR-Mut。 将 HT29 细胞消化接种至48孔板,分别转染miRNA模拟物以及阴性对照，双荧光素酶活性检测严格按照Promega提供的产品说明书操作。

1.8 统计学处理 运用SPSS17.0统计软件处理数据，数据以均数±标准差()表示，统计学方法采用完全随机设计的单因素方差分析 (one-way ANOVA)分析组间差异的显著性。

2 结果

2.1 RT－PCR检测基因的相对表达水平 miR-375在2型糖尿病患者外周血单个核细胞中呈高表达，而PRKD1呈低表达，两者的相对表达量具有负相关性运用生物学信息软件targetscan7.0软件预测到PRKD1是miR-375调控的靶基因之一。进一步运用RT-PCR检测2型糖尿病患者及正常健康外周血单个核细胞中 miR-375和PRKD1的相对表达。结果显示：miR-375在2型糖尿病患者外周血单个核细胞中呈高表达，而PRKD1呈低表达，两者的相对表达量具有负相关性，相关系数R为-0.992，P＜0.05。 结果提示 miR-375与 PRKD1在2型糖尿病患者外周血单个核细胞中的表达可能存在负性调控关系。见图1。

图1 Figure1 RT-PCR检测基因的相对表达水平

2.2 miR-375靶向调控PRKD1的表达 psiCHECK-2-PRKD1-WT-3’UTR 与 miR-375mimics共转染HT29细胞，导致荧光活性减弱，说明PRKD1-WT-3’UTR与miR-375发生结合作用。psiCHECK-2-PRKD1-mut-3’UTR 与 miR-375mimics共 转 染HT29细胞，荧光活性未发生改变，说明不存在结合作用 (Fig 2)。结果表明：miR-375靶向调控PRKD1的表达。见图2。

2.3 miR-375抑制PRKD1的表达与翻译 miR-375抑制剂组PRKD1基因与蛋白的相对表达水平上调，与空白对照组比较差异有统计学意义 (P＜0.05)。结果表明miR-375抑制PRKD1的表达与翻译。见图3。

3 讨论

图2 Figure 2 miR-375靶向调控PRKD1的表达

图3 Figure 3 miR-375抑制PRKD1的表达与翻译

糖尿病的发病因素主要包括遗传和生理的改变，主要分为1型和2型糖尿病[9]。但是，目前对于糖尿病的发病分子机制的研究尚未完全阐明。miRNAs是葡萄糖动态平衡的调节器，这种新型的非编码RNA通过与靶mRNA互补配对并结合，实施在转录后水平对基因表达进行负调控，导致mRNA降解或翻译抑制[10-11]。miRNAs在各种细胞中的的表达呈现特异性和时间依赖性，这决定了miRNAs在众多生物过程的特定环节对靶基因的表达具有重要调控作用[12]。

在胰腺和胰岛β细胞中表达的众多miRNAs中，miR-375参与调控葡萄糖引起的胰岛素分泌过程[7]。PRKD1是一种新发现的钙离子／钙调蛋白依赖性丝氨酸苏氨酸蛋白激酶，有3个家族成员，其PRKD1广泛表达于各组织和器官中，参与调控细胞内多条信号传导通路，在调节一系列细胞生物学行为、维持细胞功能方面发挥十分重要的作用[13]。在我们的研究中发现miR-375在2型糖尿病患者外周血单个核细胞中呈高表达，PRKD1呈低表达。进一步构建双荧光报告基因载体证实了PRKD1是miR-375调控的靶基因之一，miR-375具有抑制PRKD1的表达与翻译的功能。已有研究显示：miR-375通过NF-KB信号通路调控Mtpn的表达和胰岛素分泌，NF-KB激活与葡萄糖激发的胰岛素分泌相关[14-15]。

总之，我们的研究发现miR-375在2型糖尿病患者外周血单个核细胞中高表达，对PRKD1具有负向调控作用，这为揭示2型糖尿病的发病分子机制提供了线索。