2015-2017年江西省市售食品中产单核细胞李斯特菌污染情况调查及分子分型研究

周厚德，刘洋，游兴勇，刘道峰，彭思露，刘成伟

(江西省疾病预防控制中心、江西省食源性疾病诊断溯源重点实验室，江西 南昌330029)

产单核细胞李斯特菌是一种可导致人、动物共发病的革兰阳性短杆菌，该菌在自然界广泛存在，对生存环境要求不高，能耐受较高的渗透压和低温，可污染食品冷藏、加工、运输等多个环节[1]。产单核细胞李斯特菌可污染肉类、海产品等，能引起人和动物的严重感染，尤其是对免疫力低下人群(老人、怀孕妇女及新生儿)造成严重危害，是世界卫生组织(WHO)90年代列举的四大食源性病原菌之一[2]。为及时了解产单核细胞李斯特菌在市售食品中的污染情况，2015-2017年对江西省选定的24个市县的超市、百货商场等流通环节销售的12类食品(包括肉类、豆制品、速冻米面制品等)共采集4816份样品进行产单核细胞李斯特菌监测。传统血清凝集的方法进行产单核细胞李斯特菌进行分型步骤繁琐、耗时，脉冲场凝胶电泳(Pulsed Field Gel Electrophoresis,PFGE)分子分型方法具有分辨率高、重复性好等特点，已经成为食源性疾病溯源的“金标准”[3]。通过该方法对分离的产单核细胞李斯特菌进行分型，可对收集的阳性菌株进行分型归类，为进一步预防疾病发生奠定基础。现将监测结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品 在江西省24个市县(宜春市、景德镇市、萍乡市、青山湖区、修水县、青云谱区、吉州区、铅山县、奉新县、彭泽县、德安县、兴国县、上饶县、上栗县、于都县、安福县、婺源县、上高县、乐安县、德兴市、丰城市、泰和县、分宜县、余江县)的超市、百货商场等市场流通环节采集市售食品，包括肉类、海产品等。采样时包装完整、均在保质期内并且避免污染。

1.1.2 主要试剂 李斯特增菌肉汤LB(LB1、LB2)及配套试剂、鼠李糖和木糖生化管、营养琼脂(Nutrient Agar)均购自青岛海博公司，显色培养基及配套试剂购自法国科玛嘉公司。基质和靶板均购自比利时布鲁克公司，限制性内切酶AscI(英国NewEngland)，SeaKemGold(SKG)琼脂糖(美国 Cam-Brex)，蛋白酶K(美国Merck)，十二烷基肌氨酸钠、Tris-Base、EDTA 和硼酸、Gel-red(美国 Biotium)，H9812标准株 (由国家食品安全风险评估中心提供)。以上培养基和试剂均在有效期内使用。

1.1.3 主要仪器与设备 生物安全柜 (Biobase,中国)， 恒温培养箱 (EYELA LTI-1200,日本)，CHEF Mapper XA脉冲场电泳仪、Gel Doc XR凝胶成像仪均购自美国Bio-Rad。Vitek比浊仪(梅里埃,法国)，基质辅助飞行时间质谱微生物鉴定仪(MIDLITOF)(布鲁克,比利时)。

1.2 方法

1.2.1 菌株的培养与分离 产单核细胞李斯特菌检测依据国家食品污染和有害因素风险监测工作手册方法，无菌操作取样25g(mL)加入到含有225 mL的LB1增菌液中，于30℃培养24h，然后取出0.1 mL转种到10 mL的LB2培养液中，于30℃中培养24h后划线接种李斯特菌显色平板，培养24～48h后挑取显色平板上呈现小圆形蓝色菌落且周围有白色晕圈的典型菌落接种普通平板，于36℃中培养24h。采用普通生化方法鼠李糖、木糖以及质谱方法鉴定菌株，其中木糖阴性、鼠李糖阳性且质谱结果优先显示为产单核细胞李斯特菌并评分为1.8分左右的菌株鉴定为产单核细胞李斯特菌。

1.2.2 脉冲场凝胶电泳(PFGE)分型 对确定的产单核细胞李斯特菌进行脉冲场凝胶电泳分子分型，将试验用菌株和H9812标准株进行包埋，用溶菌酶使细胞在胶块中原位裂解，将包埋有菌体基因组的胶块分别用超纯水洗3次，再用TE清洗4次，洗涤后的胶块用AscI限制性内切酶进行酶切，酶切后的样品胶置于样品梳上，从胶槽下部中央缓慢倒入100mL熔化的1%SKG。冷却30 min后，拔去样品梳，将胶块放入电泳槽中，加入2.1L 0.5×TBE，进行脉冲场凝胶电泳。电泳条件：AutoAlgorithm程序49 kb低分子量，450 kb高分子量，时间19h，电泳温度14℃，其它条件选择仪器默认设置。电泳结束后，将凝胶取出，用0.1μg/mL的Gel-red染色30 min，置于纯水中脱色30 min.PFGE指纹图谱的聚类分析方法将试验获取的的DNA图谱用Bionumerics v7.6软件进行处理，识别图形条带。DNA图谱以AscI酶切的H9812作为统一的分子量标准进行校准确定条带位置。PFGE带型之间的相似度采用Dice系数来衡量，用非加权组平均法(UPGMA)进行分析，最后输出亲缘关系树状图谱[4]。

1.2.3 数据分析 采用Excel2007计算检出率 ,使用SPSS18.0(SPSS Inc,美国)进行统计分析，采用Person卡方检验(χ2)对不同产地和不同流通环节的检出率进行统计学比较，以α=0.05为检验水准。

2 结果

2.1 不同年份市售食品中产单核细胞李斯特菌检出情况 2015年至2017年共采集样品4816份，3年分别收集的样品数为1716份、1799份和1301份，检出产单核细胞李斯特菌的样品分别为38份、18份和13份，阳性率分别为2.21%、1.00%和0.99%，见表 1。

2.2 不同地区市售食品中产单核细胞李斯特菌检出情况 2015年宜春市丰城市、南昌市青山湖区、景德镇市、九江市德安县检出率相对较高，均高于均值的两倍，其中宜春市丰城市检出率最高，其余地区检出率均小于均值的两倍。2016年南昌市青山湖区、九江德安县、九江修水县、宜春市奉新县检出的阳性率高于平均值，其它地方均低于均值或未检出。2017年共有13个地市检出阳性样品，检出率均较低，其余地市均未检出。各地区三年合计检出情况存在统计学差异 (χ2=45.44,P=0.004)，见表2。

表1 2015-2017年市售食品中产单核细胞李斯特菌检出情况

2.3 不同类别食品中单核增生李斯特氏菌检出情况 2015-2017年24个监测点共收集了12大类的食品，主要包括烘培食品、餐饮食品、蛋与蛋制品、豆制品、肉与肉制品、乳与乳制品、水产品等。各类样品的检出率不尽相同，豆制品、餐饮食品、冷冻食品、速冻米面制品、肉与肉制品等产品中均有检出产单核细胞李斯特菌。其中烘培类食品、餐饮食品、肉与肉制品等检出率高于平均值；乳与乳制品、冷冻饮品、固体饮料等食品均未检出该菌；蛋与蛋制品因检测样本较少，数据不具备参考性。不同类别样品检出产单核细胞李斯特菌具有统计学差异(χ2=33.98,P＜0.001)，见表 3。

表2 2015-2017年不同地区市售食品中产单核细胞李斯特菌检出情况

2.4 不同流通环节检测结果 2015至2017年在24个监测点对在不同流通环节进行市售的食品进行了监测，主要包括餐馆、食堂、百货商场、便利店、超市、农贸市场、网店、批发市场等，市售食品中产单核细胞李斯特菌的检出情况。各流通环节之间检测情况存在显著性差异(χ2=7.84,P=0.55)。见表4。

2.5 脉冲场凝胶电泳结果 对收集的69株阳性分离株进行PFGE分子分型，其中有14株菌因电泳过程中发生降解等原因未能成功获得PFGE的完整条带，其余菌株全部进行了电泳，在电泳结果进行DNA酶切图谱聚类分析，条带位置差异容许度选择1.5%，优化值选择1%。根据条带位置及数量的不同，只有三株菌为同一PFGE型别(定义相似值100%为同一PFGE型别)，其余菌株均各自为一个型别见图1。

表3 2015-2017年12大类食品中产单核细胞李斯特菌检出情况

表4 2015-2017年各流通环节市售食品产单核细胞李斯特菌的检出情况

图1 菌株PFGE聚类结果

3 讨论

产单核细胞李斯特菌是一种细胞内源性革兰阳性细菌，该细菌具有较为强大的生存能力，能够在较冷和高盐的环境中生存，在食品生产、运输、销售等多个环节均能够产生污染，是WTO规定的4大食源性致病菌之一，该菌可引起人类脑膜炎、败血症、脓毒血症等，表现为起病急、发热(39℃以上)、意识障碍、昏迷以及小脑功能障碍等[5]。尽管目前我国还没有产单核细胞李斯特菌暴发感染的相关报道，但存在不少由该菌引起的散发病例报道[6]。产单核细胞李斯特菌一旦引发感染，病死率高达30%～70%，病人即使幸免于难，也常常会留下共济失调、失语、肢体瘫痪等后遗症。2015-2017年对江西省25个监测点采集了市售12大类食品进行了产单核细胞李斯特菌的检测，旨在研究该细菌在江西省市售食品中的分布和变化情况，更好的指导相关产品的市场管理。

三年市售食品的总检出阳性率为1.43%，存在一定程度的产单核细胞李斯特菌的污染，有引起食物中毒的潜在风险。2015年检出率相对2016、2017年高一点，达到2.21%。不同类别采集的样品比较差异有统计学意义 (χ2=33.98,P＜0.001)，在2016、2017年均减少了肉与肉制品的采样数量。三年来肉与肉制品的检出率均较高，2015年2016年和2017年分别达到3.58%、1.57%和2.12%，均在当年12大类食品中检出率排在前列，2015年的总体检出率相对高一点，可能与12大类样品采集数量尤其是肉与肉制品等检出率相对较高的食品类别采样数量差异有一定的关系。不同监测点之间检出率比较差异有统计学意义(χ2=45.44,P=0.004)，南昌市、景德镇市、九江市德安县、宜春市丰城市、新余市分宜县均相对其他地区有较高的检出率，提示赣北地区尤其是南昌市周边地区采集的样品存在相对较高的风险，这可能与这两个地区人口较多，市场流通量较大，各类样品进入市场有关，应引起相应的重视。本研究中50%的产单核细胞李斯特菌分离自生畜肉、生禽肉和熟肉制品中，这与沈托[7]、周虓[5]等对产单核细胞李斯特菌污染调查结果一致。本次研究也表明江西省肉类食品中产单核细胞李斯特菌污染较为严重，存在较高的食品安全隐患，应将肉类食品作为高危食品，在屠宰、加工、销售等各个环节严格加强卫生管理，这与江西省前期的研究较为一致[8]。通过对不同流通环节的结果分析表明，百货商场、便利店可能存在较多的产单核细胞李斯特菌污染的产品，其中百货商场的阳性样品率最高，可能与样品数目较少有关，应该加强这些场所食品安全的监督和监测，超市可能因为样品的准入门槛较高，虽然检测量大，但污染样品率低于平均水平，提示消费者去超市购买婴幼儿食品是相对安全的行为。

PFGE方法作为国际通用的分子分型方法，为进一步研究产单核细胞李斯特菌的基因同源性及溯源提供了有效的支撑。尽管该方法分型过程存在耗时长、成本高、操作复杂、带型之间比对困难等不足，但PFGE的优势在于能对所有的产单核细胞李斯特菌分离株进行有效分型，使得该项技术成为目前产单核细胞李斯特菌基因分型的最优分型方法[3]。本文对调查分离的菌株采用PFGE方法分型发现只有三株菌存在100%一致，其余菌株均存在一定带型差异，提示我省食品中分离的产单核细胞李斯特菌存在较高的基因差异。

江西地区市售食品仍然存在一定的产单核细胞李斯特菌污染风险，尤其是肉与肉制品等相关食品，相关部门应该从原料、生产环节、环境、销售等多个方面严格把关，提高监测水平并加强相关菌株的分型与溯源水平，为提升人民健康水平提供强有力的保障。