蛋氨酸限制对高脂饮食小鼠骨骼的改善作用

郭海涛，王雅楠，张佳红，施用晖，乐国伟*，2

（1.江南大学 食品学院，江苏 无锡 214122；2.食品科学与技术国家重点实验室，江南大学，江苏 无锡 214122）

随着人们膳食中糖、脂能量所占的比例不断增高，肥胖与其并发症的发病率在逐年升高[1-3]。研究表明，超重和肥胖是引起骨质疏松甚至骨折的重要因素之一[4]，高脂饮食诱导的肥胖大鼠体重的增加与骨质含量和骨密度之间呈现出负相关[5]。如何防治肥胖与骨质疏松已成为重要的健康问题。

近些年来研究证实，蛋氨酸限制（Methionine restriction，MR）饮食是一种有效降低高脂饮食体重的方法[6]。但MR对大鼠和小鼠骨骼的作用，存在体重自身变化与骨代谢的双重作用[7]。Ables等[7-8]经14周研究发现MR提高高脂饮食小鼠FGF21的表达，促进Pparγ的作用，增加胶原蛋白降解，使骨矿物质质量分数 （Bone mineral content，BMC）和骨密度（Bone mineral density，BMD）显著降低。而Huang等[9]的研究指出短期MR饮食能显著降低大鼠骨量、股骨外在骨强度，但股骨的内在骨强度却显著提高。MR饮食小鼠的BMC和BMD绝对量显著降低，但经过体质量校正的小鼠骨骼参数是正常的[7]。MR饮食对小鼠骨骼生长发育状况的影响还存在争论。肥胖时增加骨骼的负荷，一定程度刺激骨骼增长，甚至出现局部的骨质增生。因此，MR饮食对骨骼的作用不仅限于BMC和BMD等指标，需要进一步观察MR饮食对骨骼组织的微结构以及生物力学参数的影响，此外，MR作为肥胖干预的膳食，有必要观察MR饮食的时间长短对骨骼的影响及其变化。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

丙二醛（Malondialdehyde，MDA）、总抗氧化能力（Total antioxidant capacity，T-AOC） 测定试剂盒：南京建成生物工程研究所产品；氧化型谷胱甘肽（GSSG）和还原型谷胱甘肽（GSH）标准品：中国医药集团化学试剂有限公司产品；其余试剂均为分析纯：中国医药集团化学试剂有限公司产品。

1.2 仪器与设备

SX-4-10型箱式电阻炉控制箱：天津市泰斯特仪器有限公司产品；超净工作台：安泰公司产品；SpectraMax M5/M5e酶标仪：美国Molecular Devices公司产品；5804R冷冻离心机：德国Eppendorf公司产品；XB70制冰机：美国GRANT公司产品；μCT80 MicroCT：SCANCO 产品。

1.3 方法

1.3.1 实验动物与分组 4周龄清洁级雄性C57BL/6小鼠54只，初始体质量18～20 g，购自于南京大学-南京生物医药研究院。适应性饲喂1周后，随机分成3组：对照组 （4%脂肪+0.86%蛋氨酸，CON）；高脂组（20%脂肪+0.86%蛋氨酸，HF）；高脂蛋氨酸限制组（20%脂肪+0.17%蛋氨酸，MR）。

所有小鼠在同室分笼饲养，温度（23±2）℃，湿度60%，给予12 h/12 h昼夜循环光照。小鼠自由采食饮水，每周称取一次体重。饲喂11周、22周后分别对各组小鼠禁食12 h，氟烷麻醉后处死，取股骨样品。

1.3.2 组织样品制备 在冰浴上操作，迅速取出股骨，去除股骨上多余附着肌腱组织；左腿股骨分成两段，近心端一段用预冷生理盐水制备成10%组织匀浆液，并置于-20℃备用，用试剂盒测定股骨的T-AOC、MDA和GSH/GSSG。22周小鼠股骨远心端一段用于显微CT（Micro-CT）扫描检测，测定骨体积分数（Bone volume fraction，BV/TV）、骨矿物质密度（BMD）、 结构模型指数 （Structure model index，SMI）、骨小梁数量（Trabecular number，Tb.N）、骨小梁厚度（Trabecular thickness，Tb.Th）和骨小梁分离度（Trabecular separation，Tb.Sp）。 将 9 只小鼠右腿的股骨取出用游标卡尺测量股骨长度，然后用于三点弯曲试验得到股骨最大荷载值即骨强度，三点弯曲试验后收集断裂的右腿股骨，将股骨放入烘箱烘干至恒重，测量骨干重；然后将股骨放入坩埚中，碳化至无烟，放入550℃马弗炉中灰化12 h，恒重，测定灰分重量（BMC）。将另外9只小鼠的右腿股骨放入中性福尔马林中进行固定，脱钙后，进行HE染色切片，观察切片中脂肪细胞和骨小梁的生长情况。

1.3.3 数据统计分析 采用SPSS 13.0统计软件分析，用ANOVA进行多重比较和方差分析，结果采用±s表示，显著水平为P<0.05。

2 结果与讨论

2.1 小鼠体重和股骨的基础指标变化

实验22周后，与CON组相比，HF组小鼠的体重显著性升高 （P<0.05）；MR组小鼠的体重显著低于HF组（P<0.05），与对照组一致，表明MR饮食控制了小鼠体重的增长。11周后，MR组小鼠的股骨长度、骨干重、骨矿物质含量显著低于HF组 （P<0.05）；22周后，与CON组相比，HF组股骨干重、长度与BMC没有显著差异（P>0.05）；与HF组相比，MR组股骨干重和长度没有显著差异 （P>0.05），而BMC 显著增加（P<0.05）（表 1）。 综上，11周 MR 饮食，小鼠股骨长度、骨干重、骨矿物质显著降低，与Ables等[8]研究结果一致。但22周后，MR饮食控制了小鼠肥胖，而且提高了小鼠股骨干重和矿物质沉积，股骨长度与对照组接近。

表1 不同时期MR对高脂小鼠体质量，股骨长度，股骨干重和BMC的影响Table 1 Effect of MR on body mass，femur length，femur dry weight and BMC of HFD fed mice in different periods

2.2 股骨生物力学指标

股骨进行的三点弯曲试验结果显示，与CON组和MR组相比，HF组小鼠11周、22周后股骨强度显著升高（P<0.05），经过体重校正以后，股骨强度/体重显著降低（P>0.05）；MR 组 11周、22 周后骨强度及小鼠体重校正以后的股骨强度/体重均与对照组接近，而股骨强度/体重显著高于 （P<0.05）HF组（见表2）。HF组小鼠骨强度的增加是适应其体重增加的代偿性提高，经过体重校正以后，单位骨强度反而降低。与低脂肪饮食相比，大部分“西方化”饮食中糖和脂肪的含量很高，长期食用这种饮食会使体重增加，机体氧化应激水平也急剧增高[10]。在肥胖儿童体内，虽然肌肉总量较高，但是相比于同龄不肥胖的儿童来说，肥胖儿童表现出更高的骨折率[11]，表明肥胖对于骨骼的发育是不利的。无论短期还是长期MR饮食干预都会降低股骨强度，但这些降低是相对的，单位骨强度并不会降低。骨强度并不能完全代表骨骼的生长情况，骨折的发生也不是完全由骨强度决定的，想弄清楚骨骼的生长，需要与其他骨骼指标共同说明。MR组股骨中矿物质含量、骨组织体积和骨小梁厚度的增加，可能是MR组单位骨强度提高的主要原因。

表2 不同时期MR对高脂小鼠股骨生物力学的影响Table 2 Effects of MR on femur biomechanical peoperties of HFD fed mice in different periods

2.3 股骨远心端松质骨Micro-CT定量参数的变化

对22周实验小鼠远心端股骨进行3D显微CT的结果显示，与CON组相比，HF组Tb.Th和BV/TV显著降低 （P<0.05），Tb.Sp，SMI，Tb.N 和 BMD 均没有显著差异（P>0.05）；与HF组相比，MR组的Tb.Th和 BV/TV 均显著增加 （P<0.05），Tb.Sp，SMI，Tb.N，BMD 没有显著差异（P>0.05）（表 3）。结果表明，长期的MR饮食增加了骨小梁的形成速度和厚度，股骨中骨盐沉积增多，有利于骨骼生长。而本研究结果证明在小鼠体成熟以后继续饲喂MR饮食一段时间，骨盐积累会增加，BMC升高，体现了长期MR饮食可能转变了短期MR饮食对小鼠骨骼的部分不利影响。

表3 MR对高脂小鼠股骨远心端松质骨Micro-CT定量参数的影响Table 3 Microcomputed tomography（μCT）derived cancellous bone parameters at the distal femur in MR mice

2.4 股骨氧化应激水平

与CON组相比，HF组小鼠股骨MDA显著增加（P<0.05），T-AOC 显著降低（P<0.05），GSH/GSSG无显著差异（P>0.05）；与HF组相比，MR组小鼠股骨MDA显著降低 （P<0.05），T-AOC显著升高 （P<0.05），GSH/GSSG 无显著差异（P>0.05）。以上结果表明，高脂饮食会造成骨组织的氧化应激，HF组表现出抗氧化能力降低，脂质过氧化，而MR饮食使股骨MDA含量显著降低，T-AOC含量显著上升，对高脂饮食引起的机体氧化应激有很大的改善作用。氧化应激是骨质疏松的重要病因[12-13]，MR饮食对骨骼氧化应激的改善作用可能是MR饮食改善骨性能的重要原因之一[14-15]（表 4）。

表4 不同时期MR对HFD小鼠股骨氧化还原指标的影响Table 4 Effect of MR on femur oxidant stress biomarkers of HFD fed mice in different periods

2.5 股骨HE染色切片

图1是小鼠股骨远心端HE染色切片，在放大40倍情况下，与CON组相比，HF组骨小梁差异不明显，但脂肪空泡较多；MR组与HF组相比，骨小梁厚度较大，骨小梁数量差别不明显，空泡显著减少，与对照组相近。表明MR饮食可显著减少骨骼中脂肪细胞积累。从小鼠股骨远心端Micro-CT扫描结果也可看出，与CON组相比，HF组小鼠骨小梁网状结构松散，骨小梁变薄；而MR组较HF组，骨小梁更加紧密，网状结构排列密集，骨小梁有增厚迹象。

骨骼中脂肪细胞增多是骨量丢失的原因之一[16]。本研究通过对远心端股骨进行HE染色观察发现，高脂饮食刺激了骨脂肪细胞的生成，同时降低松质骨体积。可能的原因是高脂饮食可以增加骨髓间充质干细胞（MSC）向脂肪细胞分化的能力，而降低其向成骨细胞分化的能力[17]，而MR饮食显著减少了骨组织中的脂肪空泡，松质骨体积上升，表明长期MR饮食可能与MSC向成骨细胞分化的能力上升或使其向脂肪细胞分化的能力降低。

长期和短期MR饮食对骨骼造成不同影响的原因还可能是，小鼠处于体重快速增长期时需要的营养元素较多，蛋氨酸需求量也较多，此时若限制饮食中蛋氨酸含量可降低小鼠体重和骨骼的生长速度。小鼠处在体重增长平稳期时需要的蛋氨酸含量降低，此时继续进行MR饮食干预可降低机体氧化应激水平，增加骨矿含量、骨组织体积和骨小梁厚度，提高骨性能。

3 结 语

长期MR饮食干预限制了小鼠体重的增长与肥胖，股骨中矿物质含量增加、骨小梁增厚、骨组织增大、松质骨网状结构更加紧密，显著提高了单位骨强度，骨骼性能得到改善。造成这些的原因可能是长期MR饮食降低小鼠骨骼氧化应激，股骨中脂肪细胞的含量降低。长期与短期MR饮食对骨骼造成的不同影响，可能是由于小鼠处于不同的体重增长期，11周尚处于生长期，MR可能影响骨骼生长与代谢，其具体机制还有待进一步研究。

图1 MR对高脂小鼠股骨远心端松质骨显微结构的影响Fig.1 HE staining of mice distal femur in different groups