复方红景天缓解体力疲劳活性的研究

甘昌胜，王珊珊，李 鸿，蔡坤良

（合肥工业大学食品科学与工程学院，农产品生物化工教育部工程研究中心，安徽 合肥230009）

疲劳是涉及许多生理生化因素的综合性生理过程，是机体体力或脑力活动达到一定阶段时出现的正常生理现象。但若疲劳长时间得不到有效缓解，会对肌体产生一系列伤害，甚至导致器质性疾病，威胁人类健康。

红景天作为我国传统的藏药，药用历史悠久，常生长在高寒缺氧地带[1]，可在极其恶劣多变的自然环境中生长，造就了其独特的抗辐射、耐缺氧、抗疲劳、延缓人体衰老等功效，被誉为“高原人参”[2-5]。目前，红景天的抗疲劳活性已有一些报道，笔者也对红景天的活性成分及其提取物的抗疲劳活性进行了系列研究，表明具有较强的抗疲劳效果。

疲劳是一个受多重因素影响的复杂过程，中药单体一般作用比较单一，难以达到综合调理的效果，而且，红景天作为一种名贵珍稀药用植物，成本高，药价贵，适用群体有限。关于单味中药的实验报道较多见，检索了在文献中经常出现的具有抗疲劳活性的中药，发现多以滋补类中药为主，其中，补气的有人参、刺五加、红景天、灵芝、枸杞、五味子、黄精、大枣、黄芪、何首乌、绞股蓝等，补血活血的有三七、当归、阿胶、丹参等，还有补肾阳的中药，如淫羊藿、巴戟天、肉苁蓉、鹿茸等。作为中医药的一大特色，中药复方能够从不同侧面促进疲劳的缓解，综合调理，以有机的整体来认识人与疲劳的关系，注重疲劳产生的综合性和复杂性，调补相结合，使机体达到新的平衡，从而消除疲劳，恢复体力，具有其他单方或单味中药无法比拟的优势[6-8]。

本研究从补气和补血活血入手，辅以补肾阳，从上述常用的抗疲劳中药中选择了枸杞、黄精、五味子、当归和肉苁蓉，整体组方性平，久服不会燥热上火，且大多为药食同源的植物资源，即使长期服用，安全性也很高。论文在前期红景天抗疲劳功能的基础上，添加这几味中药复配组成复方，通过动物实验，研究复方对抗疲劳活性的增强效果，并进一步研究与运动小鼠的能量代谢密切相关的几种酶活性的变化，探讨抗疲劳机制，为保健品开发提供基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

大花红景天（Rhodiola crenulata）根，西藏林芝；当归 （Angelica sinensis），甘肃岷县；多花黄精（Polygonatum cyrtonemaHua）， 安徽霍山； 枸杞（Lycium barbarumL.），宁夏中宁；肉苁蓉（Cistanche deserticolaY.C.Ma），内蒙古阿拉善；北五味子（Schisandra chinensis（Turcz.） Baill），河北承德。 中药材均购自合肥大药房。生化测试试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。色谱纯乙腈、甲醇，国药集团化学试剂有限公司；水为超纯水；其余试剂均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司。

UV-1600型紫外分光光度计，北京瑞利分析仪器公司；FW177型中草药粉碎机，天津市泰斯特仪器有限公司；1260型高效液相色谱仪，美国安捷伦公司；RE52CS-1型旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂。

健康雄性昆明种小鼠，体质量20.0±2.0 g，购于安徽医科大学实验动物中心，同室分笼饲养一周，环境温度控制在25±2℃，光照12/24 h。

1.2 实验方法

1.2.1 复方中各味中药材浸膏的制备 1）红景天浸膏的制备。称取10 g已粉碎的大花红景天粉末，按照前期已优化出的提取条件，70%乙醇、料液比1∶15、75℃提取3 h。减压过滤，收集滤液，减压浓缩，回收乙醇，得红景天浸膏。

2）五味子浸膏的制备[9]。称取20 g粉碎后的五味子，选择 70%乙醇、料液比 1∶10、75 ℃提取 2 h，减压过滤，收集滤液；滤渣在同前的条件下再提取一次，合并两次收集的滤液，减压浓缩，得五味子浸膏。

3）枸杞浸膏的制备[10]。称取5g粉碎后的枸杞，加入20倍体积的水，80℃提取2h。减压过滤，收集滤液，减压浓缩，得枸杞浸膏。

4）黄精浸膏的制备[11]。称取10 g黄精，粉碎，加入15倍体积水，90℃提取2 h。收集滤液，减压浓缩，得黄精浸膏。

5）肉苁蓉浸膏的制备[12]。称取10 g肉苁蓉，选择60%乙醇、料液比1∶15、80℃提取2 h，提取2次。合并滤液，减压浓缩，回收乙醇，得肉苁蓉浸膏。

6）当归浸膏的制备[13]。称取10 g粉碎后的当归粉末，加入10倍量水，80℃提取2次，第一次3 h，第二次2 h。合并滤液，滤液旋蒸浓缩，得当归浸膏。

1.2.2 复方中各味中药活性成分含量的测定 据2010版《中国药典》，红景天中的红景天苷、五味子中的五味子醇甲、枸杞子和黄精中的多糖、肉苁蓉中的松果菊苷、当归中的阿魏酸是其主要的代表性活性成分。其中红景天苷、五味子醇甲、松果菊苷、阿魏酸采用HPLC检测[9-16]，枸杞多糖和黄精多糖含量由苯酚硫酸法测定[14]。

1）红景天苷标准曲线的绘制。HPLC条件。流动相：甲醇∶水=20∶80，检测波长：275 nm，柱温：30 ℃，进样量：10 μL；流速：1.00 mL/min。 分别配制质量浓度 为 0.057 8、0.115 6、0.231 2、0.578、1.156、1.734mg/mL的红景天苷甲醇溶液，以质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，得回归方程：

2）五味子醇甲标准曲线的绘制。HPLC条件。流动相：甲醇∶水=65∶35，检测波长：250 nm，柱温：30℃，进样量：10 μL。 配制质量浓度为 0.010 3、0.031、0.051 5、0.103、0.152、0.206、0.31 mg/mL 的溶液，进样检测，以质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，得回归方程：y=2197 9x+23.604（R2=0.999 7）。

3）松果菊苷标准曲线的绘制。HPLC条件。流动相：26.5（甲醇）∶73.5（0.1%甲酸溶液），梯度洗脱 0～17 min；29.5∶70.5，17～27 min。 检测波长：330 nm；柱温：30 ℃；进样量：10 μL；流速：1.0 mL/min。 配制质量浓度为 0.025、0.05、0.1、0.2 和 0.4 mg/mL 的松果菊苷溶液，进样检测，以质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，得回归方程：y=1 328.7x+25.385（R2=0.999 9）。

4）阿魏酸标准曲线绘制。HPLC条件。流动相：乙腈∶水=17∶83；检测波长：316 nm；进样量：10 μL；柱温：35℃。配制质量浓度为 0.025 9、0.051 8、0.077 8、0.103 7、0.129 6、0.259 2、0.388 8、0.518 4mg/mL的阿魏酸甲醇溶液。在设定的色谱条件下进行分析，以阿魏酸质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，得回归方程：y=32 790x+430.13（R2=0.998 2）。

5）葡萄糖标准曲线的绘制。配制质量浓度为5、20、35、50、65 μg/mL 的葡萄糖标准溶液。 分别吸取2.0 mL上述不同质量浓度的葡萄糖溶液，置于20 mL试管中，每支试管中加入1.00 mL 5%的苯酚，摇匀后缓慢滴加5.00 mL的浓硫酸。摇匀，静置20 min，蒸馏水作空白对照，在486 nm处测定各管吸光度。测量结果对葡萄糖质量浓度做线性回归，回归方程为y=0.013 7x+0.081 9（R2=0.999 7）。

1.2.3 复方设计 将制得的各味中药浸膏，加水定容至100 mL，得到各味中药的水溶液，配方以水溶液的体积进行配比。所有配方中含有的生药材总量都是4 g，各复方中不同组分混合后，都加水稀释至60 mL，保持与红景天单方同样的料液比1∶15（表1）。

表1 复方组成Table 1 Composition of the compounds

1.2.4 复方红景天抗疲劳活性的测定[17]1）小鼠分组。小鼠随机分成6组，每组40只，分别是安静对照组、运动对照组、配方一组、配方二组、配方三组、红景天单方组（将1.2.1节中所得红景天浸膏加150 mL水复溶），分别灌以生理盐水、配方一、配方二、配方三溶液、红景天提取物溶液，以12 mL/kg（体质量）灌胃，每日一次，连续灌胃30 d。每半个月记录小鼠体质量。

2）负重游泳实验[17]。末次灌胃30 min后，每组随机取出10只小鼠，在小鼠尾部绑上其体质量5%的铅皮，放入水深30 cm左右、水温25±0.5℃的水箱中游泳，记录小鼠自游泳开始至死亡的时间，作为小鼠力竭游泳时间。

3）血清尿素氮的测定[17]。末次灌胃30 min后，每组随机取出10只小鼠，置于30℃的水中无负重游泳90 min后取出，休息60 min，摘眼球采血0.5 mL。待凝固后离心，取血清待测，具体测定方法按照南京建成试剂盒测定。

4）血乳酸测定[17-18]。末次灌胃30 min后，每组随机取出10只小鼠，负重2%体质量在30℃的水中游泳60 min，安静15 min后采血备用。取小鼠全血0.1 mL，加入蛋白沉淀剂0.6 mL混匀，4 000 r/min离心10 min，取上清液待测，具体测定方法按照南京建成试剂盒测定[19]。

5）肝糖元测定[17，20]。末次灌胃 30 min 后，每组随机取出10只小鼠，无负重置于水温30℃的水中游泳90 min后，立即颈椎脱臼处死。取出肝脏，生理盐水漂洗后用滤纸吸干，称取肝组织50 mg，加入150μL 30%NaOH溶液，沸水浴20 min，加0.8 mL水，混匀，制成5%反应液，取反应液0.5 mL加水0.5 mL，混匀，加蒽酮试剂 2 mL，沸水浴 5 min，620 nm比色，按南京建成试剂盒要求测定。

1.2.5 复方红景天对运动小鼠能量代谢相关酶活的影响 小鼠运动方式同肝糖元的测定，运动后，立刻处死。取肝脏、血或肌肉组织测试琥珀酸脱氢酶（SDH）、肌酸激酶（CK）、三磷酸腺苷（ATP）酶活。

SDH酶活测定：取小鼠肝组织匀浆上清和肌肉组织匀浆上清，按照南京建成试剂盒要求操作，在600 nm处比色，计算5和65 s时的吸光度值差值[20-22]。

CK酶活测定：取小鼠肌肉组织匀浆上清，加生理盐水稀释为0.25%的匀浆。取20 μL 0.25%的肌肉组织匀浆，按照南京建成试剂盒说明书测定[21-23]。

ATP酶活测定：称取0.1 g肌肉组织加入0.8mL生理盐水，制备匀浆，1 500 r/min离心l0 min，取上清0.2 mL加0.8 mL生理盐水稀释成2%组织匀浆，取200 μL测ATP酶活性，具体操作见南京建成试剂盒说明书[21-23]。

蛋白定量：采用考马斯亮兰染色法，具体操作见南京建成考马斯亮兰蛋白测定试剂盒说明书[24]。

1.2.6 统计分析 实验数据采用SPSS 17.0软件处理，以均数±标准差（x0±s）表示，结果采用方差分析进行组间检验。

2 结果与讨论

2.1 复方中药材各活性成分测定结果

依据各活性成分的标准曲线，测得红景天溶液中红景天苷的质量浓度为1.2 mg/mL，五味子溶液中五味子醇甲的质量浓度为0.85 mg/mL，枸杞溶液中枸杞多糖的质量浓度为2.51 mg/mL，黄精溶液中黄精多糖的质量浓度为3.34 mg/mL，肉苁蓉溶液中的松果菊苷质量浓度为1.56 mg/mL，当归溶液中的阿魏酸质量浓度为0.05 mg/mL。从而，可以进一步计算出各组方中不同代表性活性成分的质量浓度，如表2所示。

表2 各组方中代表性活性物质的含量Table 2 Content of representative active substances in the prescription

2.2 复方红景天抗疲劳实验结果

2.2.1 对小鼠体质量的影响 灌胃期间，各组的小鼠精神状态良好，未见异常反应，不同组药物对小鼠体质量的影响见表3。由表3可以看出，随着饲养天数的增加，小鼠体质量稳速增长，增长情况略有差异，但实验期间，各组小鼠体质量增长趋势相同。各给药组与对照组相比，无统计学差异（p＞0.05），表明实验所采用的药物不影响小鼠的正常生长。

表3 不同组药物对小鼠体质量的影响（x0±s，n=40）Table 3 Effects of different drugs on body weight of mice（x0±s，n=40）

2.2.2 对小鼠力竭游泳时间的影响 运动耐力的下降是疲劳最直接和客观的一种表现，在保健品评价方法中，力竭游泳时间是反映疲劳程度的一个重要指标。由图1可以看出，与空白对照组相比，给药组小鼠游泳时间显著延长，给药组小鼠的游泳时间与空白组相比增加超过100%，都具有很高的抗疲劳活性。配方二组与配方三组优于红景天单方组，其中配方三组的游泳时间最长，而配方一组的游泳时间略低于单方组。

图1 不同组药物对小鼠力竭游泳时间的影响Fig.1 Effects of different drugs on exhaustive swimming time in mice

2.2.3 对运动小鼠血乳酸（LA）浓度和血清尿素氮（BUN）浓度的影响 通过测定小鼠运动后血乳酸的水平，可以了解其乳酸代谢情况，机体中乳酸的浓度与其疲劳程度密切正相关。由表4可知，小鼠游泳后，血LA浓度大幅度升高。与运动对照组相比，各给药组均明显降低LA浓度（p＜0.05），其中配方三组差异极显著（p＜0.01）；配方一组和二组的LA水平也显著低于红景天单方组（p＜0.05）。同时，运动后小鼠血清BUN大幅度提高，给药组均能显著降低BUN浓度，其中配方一组与红景天单方组基本相当，配方三组降低BUN幅度最大，表现出良好的清除运动小鼠代谢产物的能力。

2.2.4 对运动小鼠肝糖元质量分数的影响 运动耐力的强弱与机体糖元的储备量有着密切的联系，机体的糖元储备和血糖水平直接影响运动耐力水平。由表5看出，游泳后小鼠体内的肝糖元含量急速下降，给药后，与运动对照组相比，有所增加。其中，配方一组与红景天单方组效果基本相当，对运动小鼠的肝糖元增加较少；配方二组和三组相比运动对照组提升显著。文献报道大量运动后肝脏组织损害严重，影响细胞的正常代谢和肝糖元合成。添加适量的肉苁蓉可通过降低乳酸脱氢酶LDH 5的活性以及上调一氧化氮合酶NOS 3的表达来保护肝脏和促进乳酸的糖异生过程，从而促进体能恢复[25]。适当增加具有补血活血功能的当归用量，能改善血液循环，提高运输氧及各种原料的能力，加速糖元合成，有利于维持机体处于正常生理代谢水平。

2.3 复方红景天对运动小鼠能量代谢相关酶活的影响

疲劳的产生及其缓解与运动时的能量供给密切相关。线粒体被称为细胞内的 “能量工厂”，SDH是反映线粒体功能的标志酶之一，其活性一般可作为评价三羧酸循环运行程度的指标。ATP酶是一类能将三磷酸腺苷催化水解为二磷酸腺苷和磷酸根离子的酶，释放的能量可以通过传递而被用于驱动另一需要能量的反应。CK催化三磷酸腺苷和肌酸，生成磷酸肌酸，是一个与细胞内能量运转、肌肉收缩、ATP再生有直接关系的重要激酶。本节研究了不同药物组对SDH、CK、ATP酶活性的影响，以进一步考察对运动小鼠能量代谢的干预作用，初步探讨抗疲劳机制。

2.3.1 对运动小鼠SDH活力的影响 由表6可以看出，小鼠运动后SDH活性具有明显组织特异性。与安静对照组相比，游泳小鼠肝组织SDH显著降低，给药后有所升高，其中配方二组和配方三组的小鼠肝SDH含量较高，已接近安静组水平；而小鼠骨骼肌SDH在运动后活性有所升高，给药后小鼠SDH活力较安静组有所升高，但低于运动对照组，其中配方三与运动对照组无显著性差异。提高SDH活力，有利于有氧代谢过程的顺畅进行，促进运动过程中能量的供给。

表6 不同组药物对游泳小鼠SDH活力的影响Table 6 Effects of different groups of drugs on SDH activities after swimming in mice（x0±s，n=8）

2.3.2 对运动小鼠体内CK活力的影响 在一定程度上，血清CK水平的高低与横纹肌损害程度有关，肌细胞受损后，CK会经细胞间隙渗透到淋巴液，最终进入血液循环，间接引起血清CK增加。由表7可以看出，与安静组相比，游泳小鼠体内骨骼肌和血清中的CK活力均有升高趋势，这是因为正常状态下，CK处于肌肉中，它的功能是使肌酸上増加磷酸基团，转化为高能分子磷酸肌酸，释放能量。当肌肉损伤时，CK不能正常发挥功能，CK由肌肉细胞进入血液，在血液中检测到CK含量增加，暗示肌肉损伤发生[26]。给药组与运动对照组相比，血清CK活力均有所下降，其中配方三组降低显著（p＜0.05），基本接近正常水平，表明红景天复配各味中药材大大降低了运动后细胞膜的损伤程度。而对于骨骼肌CK活力，运动组和给药组与安静组相比，均有所升高，其中只有配方三组与运动对照组有显著性差异（p＜0.05）。

表7 各组药物对小鼠血清和骨骼肌CK活力的影响Table 7 Effects of different groups of drugs on CK activities in serum and skeletal muscle in mice after swimming（x0±s，n=8）

2.3.3 对运动小鼠骨骼肌ATP酶活力的影响ATP酶活性高低可以反映机体能量代谢的水平。由表8可以看出，相比较安静组，运动组小鼠骨骼肌中的Na+K+-ATP酶活和Ca2+Mg2+-ATP酶活均显著降低，给药后，酶活均有所升高，其中配方三组对Na+K+-ATP酶活的提高极显著（p＜0.01），接近正常水平，配方二组也较显著（p＜0.05），而配方一组和红景天单方组提高Na+K+-ATP酶活的能力无统计学差异，都低于配方二组和配方三组。对于Ca2+Mg2+-ATP酶活，相比较运动对照组，各给药组中只有配方三组提升显著（p＜0.05），其他组增加不明显。

表8 不同组药物对游泳小鼠骨骼肌ATP酶活影响Table 8 Effects of different groups of drugs on ATPase activity of skeletal muscle after swimming in mice（x0±s，n=8）

3 结语

1）确定了复方红景天抗疲劳药物中的各药材的提取工艺，并通过其中代表性物质的标准曲线，分析了各提取物中活性物质五味子醇甲、枸杞多糖、黄精多糖、松果菊苷、阿魏酸的含量。

2）以兼补气血、辅以补肾阳思路，保持中药原药总量4.0 g，确定了三组复方的组方。通过小鼠游泳实验，以及血清BUN、血LA、肝糖元的测定，分析比较了各组方和单方红景天的抗疲劳活性。结果表明各配方组均能提高运动小鼠的抗疲劳效果，配方二组和三组的活性优于一组和单独红景天组，综合比较，配方三组的活性更佳。

3）通过对运动小鼠体内SDH、CK、ATP酶活的测定，进一步分析了各组方的抗疲劳活性，并从能量代谢方面对抗疲劳机制进行了初探。