减压-超声波联用提取红松籽油动力学模型及油脂组成、抗氧化活性研究

王凤娟，夏晓雨，张 娜，符 群，郭庆启，3

（1.东北林业大学 林学院，黑龙江 哈尔滨 150040；2.哈尔滨商业大学 食品工程学院，黑龙江 哈尔滨 150076；3.黑龙江省森林食品资源利用重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150040）

红松属于长青乔木，其坚果通常长9～12 mm，含油量高。红松籽油本身营养价值丰富，其脂肪酸含量高达70%左右，其中含有50%多不饱和脂肪酸（PUFA），40%单不饱和脂肪酸（MUFAs）和10%饱和脂肪酸（SFAs）。《本草纲目》记载：“松仁味温，味甘，无毒，主治关节风湿，头眩，润五脏，逐风痹寒风，补体虚，滋润皮肤，久服轻身不老”。现代研究表明红松籽油具有调节血脂[1]、抗氧化[2]、抗炎[3]、减肥[4]等功能。

随着现代高新工程技术的发展，酶辅助提取法[5]、超临界CO2萃取[6]以及超声波技术[7]等正逐渐的应用于油脂工业中。但酶辅助提取法提取油脂需进行破乳且油脂与蛋白质不易分离，酶制剂价格昂贵，应用于工业生产有一定的局限性。超临界CO2萃取技术得率高，但提取周期长，设备一次性投资较高。超声波提取技术具有节约溶剂、简化提取步骤、提高有效成分得率等优点。大多数功能性食品有效成分具有热敏性，减压条件下容器内气压低，溶剂分子间分子链的能量减少，沸点降低。同时超声波可改变物质介质形态，加速化学反应和触发新的反应通道[8]。空化作用加大分子间的加速度及其对分子链和细胞壁的作用[9]，因此将减压技术与超声波提取技术联用可以更有效的提高目标物质得率。近年来，减压耦合超声技术广泛应用于丹参、茶多酚的研究中[10-11]，但应用于红松籽油未见报道。

本试验旨在研究减压-超声波联用提取红松籽油单因素的基础上，采用提取动力学反映不同超声波功率在不同时间条件下对红松籽油提取效果的影响[12]，并采用OriginPro 8 软件将不同多项式方程与动力学提取过程进行模型拟合，对最佳方程模型进行试验验证。通过气相色谱-质谱联用技术（GC-MS）检测减压-超声波联用提取的红松籽油脂肪酸组成并测定抗氧化活性，为红松籽油的提取和工业化规模生产提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

试剂：1，1- 二苯基-2- 三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）（≥98%），购于Sigma 公司；2，2-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（2,2’-azino-bis-3-ethylbenzothiazoline-6-sulfoniic acid，ABTS）（≥98%），购于Sigma公司；所用化学试剂均为分析纯。

试验仪器：7890-5973N 型气质联用仪（GCMS），美国Agilent 公司；UV-5500PC 紫外可见分光光度计，上海元析仪器有限公司；高功能粉碎机，天津泰斯特仪器有限公司；RE-2000A 旋转蒸发器，巩义市予华仪器有限公司；DL-6M离心机，湖南星科科学仪器有限公司。减压-超声波联用装置为实验室自制，其中超声波清洗机型号为SB25-12 DTD，宁波新芝生物科技股份有限公司制造；SHB-IIIG 真空泵，郑州长城科工有限公司制造。

1.2 试验方法

1.2.1 原料预处理

红松籽产自黑龙江省伊春市，将种籽剥去外壳及种皮后在60 ℃烘干至恒重（质量差＜0.002 g），粉碎过80 目筛。处理后的红松籽粉装入密封袋，4 ℃条件下保存备用。经测定其水分含量为6.52%，粗脂肪含量为68.76%。

1.2.2 理化性质测定方法

水分，GB/T 50093—2016；粗脂肪，GB/T 5512—2008；酸值，GB/T 5009.229—2016；碘值，GB/T 5532—2008；皂化值，GB/T 5534—2008；过氧化值，GB/T 5009.227—2016。

1.2.3 红松籽油脂肪酸组成测定

红松籽油甲脂化按照GB/T 17376—2008 方法进行；

色谱分析条件：DB-5MS 石英毛细柱色谱柱（30 m×250 µm×0.25 µm）；柱升温程序：初温60 ℃，以10 ℃/min 升至270 ℃，保留5 min，再以8 ℃/min 升至300 ℃，保留8 min；进样口温度270 ℃，色谱-质谱接口温度260 ℃；载气:氦气；载气流量：1.0 mL/min；用于电子冲击的电离能量70 eV；质量范围50～550m/z；气质分析结果与数据库检索比对，确定各峰代表的物质，并根据峰面积计算每个成分的相对含量。

1.2.4 减压-超声波利用提取红松籽油单因素试验

准确称取烘干至恒质量的样品5.00 g，在真空度为0.08～0.09 MPa，分别选用丙酮、正己烷、石油醚（30～60 ℃）、无水乙醇进行减压-超声波联用试验确定最佳提取溶剂后，在一定超声波功率和超声温度下，以一定料液比提取25 min，4 000 r/min 离心10 min 后，取上清液在45 ℃下旋蒸至恒重，计算红松籽油得率，确定最佳提取工艺。得率计算公式如下：

得率/(g·100g-1)= [最终油脂质量(g)/初始红松籽质量(g)]×100。

1.2.5 减压-超声波联用提取动力学模型设计

本试验在减压-超声波联用提取红松籽油单因素的基础下，研究不同超声波功率在不同时间条件下对红松籽油得率的影响。对该过程进行拟合，确定最佳提取方程模型后进行验证，并采用Fick扩散公式计算扩散速率并分析。

1.3 红松籽油的抗氧化能力测定

1.3.1 红松籽油对DPPH 自由基的清除能力

以无水乙醇为溶剂，采用分光光度法测定红松籽油清除DPPH 自由基能力[13-14]，按照下式计算清除率：

式中：A为样品（不同质量浓度样品溶液）与DPPH 自由基混合溶液的吸光度；A0为样品（同上）与无水乙醇混合溶液的吸光度；A1为无水乙醇与DPPH 自由基混合溶液的吸光度。

1.3.2 红松籽油对ABTS+自由基的清除能力

无水乙醇为溶剂，采用分光光度计法测定红松籽油清除ABTS+自由基的能力[15]，按照下式计算其清除率：

式中：A为样品（不同质量浓度样品溶液）与ABTS+自由基混合溶液的吸光度；A0为样品（同上）与无水乙醇混合溶液的吸光度；A1为无水乙醇与ABTS+自由基混合溶液的吸光度。

2 结果与分析

2.1 减压-超声波联用提取红松籽油工艺条件的确定

2.1.1 溶剂对减压-超声波联用提取红松籽油得率的影响

本研究中采用四种溶剂（丙酮、正己烷、石油醚（30～60 ℃）、无水乙醇）作为提取溶剂，加入粉碎烘干后红松籽仁5.00 g，在真空度为0.08～0.09 MPa，料液比1∶7（g∶mL），超声波温度45 ℃，超声波功率210 W 条件下，超声波提取25 min，结果如图1所示。

图1 溶剂对红松籽油得率的影响Fig.1 Effect of solvents on the yield of Korean pine seed oil

各溶剂得率顺序为：正己烷＞石油醚＞丙酮＞无水乙醇，正己烷提取红松籽油得率显著高于丙酮和无水乙醇（p＜0.05），为52.11%，石油醚提取红松籽油的得率为50.83%。洪晴悦等[16]以油用牡丹籽为原料，利用超声波辅助提取牡丹籽毛油时筛选最佳溶剂时，正己烷与石油醚得率差异不显著，但考虑到安全性选用正己烷为提取溶剂。宋于洋[17]研究沙棘籽油有机溶剂提取工艺中得出，以正己烷为溶剂的样品得率和溶剂回收率均高于以石油醚为溶剂的样品。根据《食品添加剂使用标准》（GB 2760—2014）食品工业用加工助剂中规定正己烷和石油醚均可作为提取溶剂使用，但正己烷可用于大豆油加工工艺，故选用正己烷为最佳溶剂。

2.1.2 超声波功率对减压-超声波联用提取红松籽油得率的影响

以正己烷为提取溶剂，在真空度为0.08～0.09 MPa，料液比1∶7（g∶mL），超声波温度45 ℃条件下，超声25 min，考察不同超声波功率对红松籽油得率的影响，结果如图2所示。

图2 超声波功率对红松籽油得率的影响Fig.2 Effect of ultrasonic power on the yield of Korean pine seed oil

在超声波功率150～210 W 时红松籽油得率随着超声波功率的增大而增加，其原因可能是超声波功率的增大，加剧分子间的扩散速度，机械作用及空化效应相应增加，共同促进溶剂分子间的相互作用，有利于红松籽油的释放；超声波功率为210～300 W 时，得率随超声波功率的增加而减少，其原因可能是当超声波功率超过一定值后，溶剂内渗透压达到平衡，溶剂运动状态减缓，从而减少物料与溶剂的相互接触，导致红松籽油得率下降[18-19]，故最佳超声波功率为210 W。Ai-Jun 等[20]认为随超声波功率加大，溶剂表面张力系数和粘度系数降低，有利于产生空化气泡。当功率达到一定值后，蒸汽压的增加导致空化强度或空化效应下降，故随着超声波功率加大，得率先增加后减小。

2.1.3 温度对减压-超声波联用提取红松籽油得率的影响

以正己烷为提取溶剂，在真空度为0.08～0.09 MPa，料液比1∶7（g∶mL），超声功率210 W，超声25 min，考察不同超声波温度下对红松籽油得率的影响，结果如图3所示。

图3 超声波温度对红松籽油得率的影响Fig.3 Effect of ultrasonic temperature on the yield of Korean pine seed oil

当温度为35～45 ℃时，得率随温度的升高而增加，这可能是由于溶剂提取速度主要取决于扩散系数，当颗粒大小和溶剂半径确定时，扩散系数取决于温度。随着提取温度的升高，溶剂与油分子的动态能量增加，分子间运动速率增加加速红松籽油的释放，红松籽油得率提高[21]。在提取温度为45 ℃时得率达到最高。当温度为45～60 ℃时，随着温度的升高，红松籽油得率逐渐降低。当超声温度高于45 ℃后，达到正己烷负压状态下的沸点温度，导致溶剂与物料的接触时间缩短；高温致使油脂分解，少量挥发性油损失，导致红松籽油得率下降[22]，试验最佳超声波温度为45 ℃。YANG 等[23]在利用超声波提取黄芩苷时得到类似结果。Moradi N 等[24]认为空化和热效应影响得率，空化引起气化泡内爆，导致更高的湍流度，热效应升高溶质的溶剂热度，降低溶剂黏度从而增加跨细胞传质。当温度高于最适温度时，气化效应随温度的升高而降低，热效应本身不做贡献，得率降低。

2.1.4 料液比对减压-超声波联用提取红松籽油的影响

以正己烷为提取溶剂，在真空度为0.08～0.09 MPa，超声功率210 W，超声温度45 ℃，超声25 min，考察不同料液比对红松籽油得率的影响，结果如图4所示。

图4 料液比对红松籽油得率的影响Fig.4 Effect of solid-liquid ratio on the yield of Korean pine seed oil

料液比在1∶4～1∶7 的范围内，红松籽油得率呈上升趋势，当料液比达到1∶7 时，得率达到53.01%±0.30%。其原因可能是溶剂量的增加改变原料与溶剂间的浓度差异，促进溶剂与物料的接触。当料液比在1∶7～1∶9 的范围内，得率无明显增加。可能是扩散速率已达到最大值，溶剂的增加对红松籽油得率影响不大[25]。Moradi N[24]研究了料液比对葵花籽油得率的影响时认为当料液比达到一定阈值后，增加溶剂量对得率无显著影响。

为比较减压-超声波联用与单独超声波对红松籽油提取效果的差异性，以正己烷为溶剂，在超声波功率210 W，超声波温度45 ℃，超声时间25 min，料液比1∶7（g∶mL），4 000 r/min 离心10 min 后，取上清液在45℃下旋蒸至恒重，测定红松籽油得率，做3组平行对照试验。经计算后得出，其得率为50.25%±0.46%，减压-超声波联用提取比超声波提取红松籽油的得率提高2.76%。

2.2 减压-超声波联用提取红松籽油动力学

2.2.1 减压-超声联用提取红松籽油动力学方程的拟合

以正己烷为提取溶剂，超声波温度45 ℃，料液比1∶7（g∶mL），真空度0.08～0.09 MPa条件下，考察不同超声波功率和时间对红松籽油得率的影响，结果如图5所示。

图5 不同减压-超声波功率下得率随时间的变化Fig.5 Changes of the yield under different decompression assisted ultrasonic power and time

由图5可知，在一定超声波功率条件下，得率随时间的延长而增加。在5～20 min 时，得率的增加较为明显，可能是由于这一阶段处于传质的洗涤和扩散阶段[26]，胡爱军等[27]研究超声波提取油脂动力学发现，在洗涤过程油脂整体呈现核-壳结构，随提取时间的延长，该结构中核不断缩小，壳厚度增加。充分搅拌提取液时，溶质穿过壳层向溶剂扩散；在20～30min 时，不同超声波功率提取条件下得率的增加较为缓慢，红松籽油向溶剂的浸出接近平衡[32]。

采用不同多项式方程拟合试验数据，结果见表1。表中相关系数（R2）越大，表示该模型越能准确描述不同提取功率在不同时间条件下红松籽油的提取动力学过程。由表1可知，在超声波功率150 W、180 W、210 W 时，最能反映红松籽油得率随超声波时间和功率变化的动力学方程为Boltzman 模型，对应的R2分别为0.986 6、0.979 8、0.995 3。为进一步验证动力学方程模型的准确性，分别选取两个不同时间点，测定红松籽油得率，并对比预测值和实测值，结果如表2所示。

表1 不同减压-超声波功率条件下提取模型的拟合参数Table 1 Fitting parameters of extraction models under different decompression assisted ultrasonic power

表2 减压-超声波联用提取红松籽油提取动力学模型验证Table 2 Verification of dynamic extraction model of Korean pine seed oil under decompression assisted ultrasonic power

由表1和表2可知玻尔兹曼动力学模型最能反映红松籽油得率随时间的变化，相关系数R2≥0.979 8。对该模型进行验证，由表2可知，红松籽油的预测值和实测值的拟合程度变化范围是0.951 8～0.977 0，拟合程度较好，故玻尔兹曼动力学模型能很好的反应提取动力学过程。

2.2.2 减压-超声波联用提取红松籽油过程中的扩散系数

减压-超声波联用提取红松籽油的扩散过程可以采用Fick 扩散公式描述，在不同提取压力条件下对应的扩散系数如表3所示。

表3 不同提取功率下的扩散系数值Table 3 Deff values under different extraction power

本项研究中，通过菲克第二定律推导出的有效扩散系数结果如表3可知，红松籽油的有效扩散系数与超声波功率呈现正相关。随着超声波功率的增加，有效扩散系数从1.489 4×10-11m2/min增加到2.513 4×10-11m2/min。这可能是由于功率的增加为传质提供推动力，红松籽油与溶剂接触频率增多，加快了浸出进程。

2.3 减压-超声波连用提取的红松籽油理化性质及脂肪酸组成

2.3.1 减压-超声波联用提取的红松籽油理化性质

对红松籽油的理化性质进行测定，结果如表4所示。

表4 减压-超声波联用提取红松籽油的理化性质Table 4 Physicochemical properties of Korean pine seed oil under decompression assisted ultrasonic

从表4可知，红松籽油的碘值大于130 g/100 g，说明其为干性油脂，是高度不饱和脂肪酸且酸值小于国标（≤4.0 mg/g），过氧化值小于国标（≤0.25 g/100 g）。红松籽油皂化值大于大豆油标准（189～195 mg/g）。采用减压-超声波联用提取所得红松籽油的酸值，过氧化值均达到国家食用油标准。

2.3.2 减压-超声波联用提取的红松籽油脂肪酸组成

由图6和表5可知，红松籽油中主要含有8种脂肪酸，分别为棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、皮诺敛酸、花生一烯酸、花生二烯酸、花生三烯酸。亚油酸含量最高，为46.27%，油酸次之，为28.95%。红松籽油中的亚油酸含量与张思桐等[28]研究不同品系中红松籽油脂肪酸分布特征中亚油酸含量43.20%～46.14% 相符。亚油酸有助于抑制动脉血栓的形成和降低血清胆固醇，在预防心脑血管疾病方面有重要作用。由于亚油酸是一种必需脂肪酸，人体无法合成，必须从食物中摄取，所以人们以亚油酸含量的高低作为评价食用油质量好坏的指标之一[29]。棕榈酸和硬脂酸为饱和脂肪酸，其含量均在4.00%以下。红松籽油不饱和脂肪酸高达90.00%，远远高于饱和脂肪酸。皮诺敛酸含量为13.26%。皮诺敛酸是红松籽油中独特的脂肪酸成分，参与类花生素的生物合成并刺激机体分泌抑制食欲的胆囊收缩素和胰高血糖素样肽，向大脑中枢传递“饱腹感”，降低食欲[30]。此试验中也检测到少量的二十碳一烯酸（1.04%）、二十碳二烯酸（0.54%）和二十碳三烯酸（0.82%）。

图6 减压-超声波联用提取的红松籽油脂肪酸气相色谱图Fig.6 Gas chromatogram of fatty acid in Korean pine seed oil extracted by decompression assisted ultrasonic

表5 减压-超声波利用提取的红松籽油的脂肪酸组成及含量Table 5 Fatty acid composition and content of Korean pine seed oil extracted by decompression assisted ultrasonic

2.4 减压-超声波联用提取的红松籽油体外抗氧化能力测定

2.4.1 不同浓度红松籽油对DPPH 自由基的清除作用

由图7可知，在4～16 mg/mL 范围内，DPPH自由基清除率由31.08%增加至74.13%，随着红松籽油浓度的升高逐渐增大；在16～24 mg/mL 范围内，清除率缓慢增加后逐渐趋于平缓。当样品浓度为24 mg/mL 时，清除率达到84.36%，而VE在浓度为24 mg/mL 时，清除率已达到93.06%。红松籽油对DPPH 自由基的IC50值为8.20± 0.77 mg/mL，VE的IC50值是6.22±1.77 mg/mL。VE 和红松籽油对DPPH 自由基清除率的差异不大。Wei 等[31]研究发现山核桃、巴西松子的清除率分别为79.20%、62.50%；王媛等[32]发现采用超声波技术提取的葡萄籽油在浓度为25 mg/mL 时，其DPPH 自由基清除率达到80.00%左右。本试验采用减压-超声波联用提取的红松籽油与DPPH 清除能力呈正相关，表明红松籽油具有良好的抗氧化能力。

图7 红松籽油和VE 对DPPH 自由基的清除作用Fig.7 DPPH radical scavenging capacity of Korean pine seed oil and VE

2.4.2 不同浓度红松籽油对ABTS+自由基的清除作用

由图8可知，随着红松籽油和VE质量浓度的升高，对ABTS+自由基的清除能力呈现先增加后趋于平缓的趋势。红松籽油在4～24 mg/mL 的范围内，清除率由41.16%迅速增加至92.86%后趋于平缓。在浓度为24 mg/mL 时，红松籽油清除率达到最大值93.27%，VE对ABTS+自由基的清除能力达到98.82%。红松籽油对ABTS+自由基清除能力的IC50值为7.74±0.06 mg/mL，VE的IC50值为5.72±1.10 mg/mL。余甘子核仁油对ABTS+自由基清除能力与本试验中红松籽油对ABTS+自由基清除能力趋势相同，均表现为在一定范围内随着样品浓度的增加清除能力逐渐增大，之后趋于平缓。从IC50值来看，几种油对ABTS+自由基清除能力大小的顺序为：红松籽油＞葡萄籽油＞余甘子仁油＞裸仁南瓜籽油＞亚麻籽油[33-34]。

图8 红松籽油和VE 对ABTS+自由基的清除作用Fig.8 ABTS+ radical scavenging capacity of Korean pine seed oil and VE

3 结论与讨论

单因素试验优化得出减压-超声波联用提取最佳工艺条件为：在真空度为0.08～0.09 MPa 的条件下，以正己烷为提取溶剂，在料液比1∶7（g∶mL），超声功率为210 W，温度45 ℃条件下超声25 min，红松籽油的得率是（53.01%± 0.30%）；拟合不同减压-超声辅助提取功率下红松籽油的得率随时间变化的动力学过程得知，玻尔兹曼学模型拟合程度较高，相关系数R2≥0.979 8。验证试验中实测值与预测值之间拟合度≥0.951 8。说明此拟合模型是可靠的。研究表明，减压-超声波联用技术与超声法、抽真空-回流法提取效果接近，均高于常规回流提技术。该技术通过降低容器内压强，减少溶液间的分子压力，进而降低提取过程中的能耗，缩短提取时间，降低提取温度，有利于保护热敏性成分物质的抗氧化活性[9,11]。

测定脂肪酸组成可知，红松籽油不饱和脂肪酸高达90.00%，亚油酸含量最高，为46.27%，油酸次之，为28.95%，其中松籽油中独特的不饱和脂肪酸—皮诺敛酸高达13.26%。采用减压-超声波联用提取的红松籽油酸值、碘值均符合国标，碘值163.70 g/100 g 远高于不同品系红松籽油碘值最大值127.22 g/100 g[28]。皂化值是判定平均相对分子量大小的指标，皂化值越大，平均分子量越大，红松籽油的皂化值205.77 mg/g，不同区域红松籽油的皂化值179～181 mg/g[35]。其DPPH 自由基和ABTS+自由基清除能力的IC50值分别为8.20± 0.77 mg/mL、7.74±0.06 mg/mL，具有一定的抗氧化活性能力。减压-超声波联用提取的红松籽油脂肪酸含量与下一步将对红松籽油中的多不饱和脂肪酸进一步分离纯化，并研究其功能性。