外周血ADAM8、IRF1表达水平与支气管哮喘患儿肺功能的相关性研究

王开梅 胡祥英 郑光强 邱文海 林志雄

[摘要] 目的 研究外周血去整合素金属蛋白酶8（ADAM8）、干扰素调控因子1（IRF1）的表达水平与支气管哮喘（BA）患儿肺功能的相关性。 方法 选择2018年1～8月在海口市妇女儿童医院（以下简称“我院”）接受治疗的84例BA患儿作为观察组，根据病情严重程度将其分为轻度组（30例）、中度组（44例）、重度组（10例）。另选同期在我院进行体检的健康儿童80名作为对照组。检测并比较各组肺功能指标及外周血ADAM8、IRF1的mRNA及蛋白表达水平，分析观察组患儿外周血ADAM8、IRF1的蛋白表达与其肺功能指标的相关性。 结果 观察组及轻、中、重度组外周血ADAM8、IRF1的mRNA及蛋白表达水平均明显高于对照组，差异均有高度统计学意义（P < 0.01）;重度组和中度组外周血ADAM8、IRF1的mRNA及蛋白表达水平明显高于轻度组，且重度组高于中度组，差异均有统计学意义（P < 0.05）。观察组及轻、中、重度组患儿第1秒用力呼气容积（FEV1）、FEV1与用力肺活量的比值（FEV1/FVC）及呼气峰流速（PEF）均低于對照组，差异均有统计学意义（P < 0.05）;重度组和中度组FEV1、FEV1/FVC及PEF均明显低于轻度组，且重度组低于中度组，差异均有统计学意义（P < 0.05）。Pearson相关性分析结果示，患儿外周血ADAM8、IRF1的蛋白表达与其FEV1、FEV1/FVC及PEF均呈负相关（rADAM8=-0.780、-0.773、-0.682，均P < 0.01;rIRF1=-0.684、-0.710、-0.768，均P < 0.01）。 结论 BA患儿外周血ADAM8和IRF1表达水平明显升高，且二者与肺功能具有密切关系，临床上可考虑将二者纳入BA患儿的监测靶点，从而辅助诊治过程。

[关键词] 外周血;去整合素金属蛋白酶8;干扰素调控因子1;支气管哮喘;肺功能;相关性

[中图分类号] R725.6          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-7210（2019）08（c）-0095-05

[Abstract] Objective To study the correlation of the expression of deintegrin metalloproteinase 8 （ADAM8）， interferon regulatory factor 1 （IRF1） in peripheral blood and pulmonary function in children with bronchial asthma （BA）. Methods Eighty-four children with BA who were treated in Haikou Women & Children Hospital （"our hospital" for short） from January to August 2018 were selected as observation group， and they were divided into mild group （30 cases）， moderate group （44 cases） and severe group （10 cases） according to the severity of the disease. Eighty healthy children who underwent physical examination in our hospital at the same time were selected as control group. The pulmonary function indices， the expression levels of ADAM8， IRF1 mRNA and protein in peripheral blood of each group were detected and compared. The correlation between the expression of ADAM8， IRF1 protein in peripheral blood and pulmonary function indices was analyzed. Results The expression levels of ADAM8， IRF1 mRNA and protein in peripheral blood of observation group and mild， moderate， severe group were significantly higher than those of the control group， the differences were highly statistically significant （P < 0.01）; the expression levels of ADAM8， IRF1 mRNA and protein in peripheral blood of the severe group and moderate group were significantly higher than the mild group， and those of the severe group were significantly higher than the moderate group， the differences were statistically significant （P < 0.05）. The forced expiratory volume in 1 second （FEV1）， FEV1/forced vital capacity （FEV1/FVC）， peak expiratory flow （PEF） in the observation group and mild， moderate， severe group were significantly lower than the control group， the differences were statistically significant （P < 0.05）. The levels of FEV1， FEV1/FVC and PEF in the severe group and moderate group were significantly lower than the mild group， while the severe group was significantly lower than the moderate group， the differences were statistically significant （P < 0.05）. Pearson correlation analysis showed that， the expression of ADAM8， IRF1 protein was negatively correlated with FEV1， FEV1/FVC and PEF （rADAM8=-0.780， -0.773， -0.682， P < 0.01; rIRF1=-0.684， -0.710， -0.768， P < 0.01）. Conclusion The expression of levels ADAM8 and IRF1 in peripheral blood of children with BA are significantly increased， and it is closely related to pulmonary function. It can be considered as the monitoring target of children with BA， in order to assist the diagnosis and treatment process.

[Key words] Peripheral blood; Deintegrin metalloproteinase 8; Interferon regulatory factor 1; Bronchial asthma; Pulmonary function; Correlation

支气管哮喘（bronchial asthma，BA）属于儿童时期的常见病及多发病，患儿通常会产生急性发作的症状，如出现呼吸道平滑肌的持续性痉挛，损害正常肺通气功能，并可引起呼吸功能障碍，常需及时予以药物干预[1]。临床治疗BA的药物主要有糖皮质类激素药物和长效β2激动剂等，虽能产生一定的疗效，但在患儿病情较重时则应用效果不佳，这就使得寻找新型治疗靶点显得尤为重要[2]。去整合素金属蛋白酶8（deintegrin metalloproteinase 8，ADAM8）属于保守性较高的跨膜分泌糖蛋白，其与气道炎症细胞在机体内的迁移具有一定关联。干扰素调控因子1（interferon regulatory factor 1，IRF1）属于转录因子的一个家庭成员，其可在细胞免疫及分化过程中发挥作用[3-4]。本研究通过分析外周血ADAM8及IFR1表达与BA患儿肺功能的关性，旨在为临床诊治BA选择新型监测靶点，并提供数据支持，现报道如下：

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2018年1～8月在海口市妇女儿童医院（以下简称“我院”）接受治疗的BA患儿84例作为观察组。纳入标准：①符合《儿童支气管哮喘诊断与防治指南》[5]中关于BA的诊断标准;②年龄≤12岁;③患儿家属对本研究知情并签署知情同意书。排除标准：①合并呼吸系统其他疾病者;②合并血液系统疾病、感染性或免疫性疾病者;③有创伤或恶性肿瘤者;④入组前4周内应用过激素及免疫抑制剂等药物治疗者。84例观察组患儿中，男43例，女41例;年龄4～12岁，平均（7.95±0.45）岁;平均病程（18.36±3.20）个月。根据《儿童支气管哮喘诊断与防治指南》[5]中病情严重程度评分标准将BA患儿分为轻度组（30例）、中度组（44例）、重度组（10例）。另选同期在我院进行体检的健康儿童80名作为对照组，男45名，女35名;年龄5～12岁，平均（7.97±0.59）岁。两组性别、年龄比较，差异无统计学意义（P > 0.05），具有可比性。本研究已经我院医学伦理委员会审核及批准。

1.2 仪器与试剂

瑞士Roche公司生产的TRIzol（货号：15596026）;瑞士Roche公司生产的蛋白裂解液（批号：161306）;BECKMAN OPTIMA XPN-100超速离心机，离心半径为10 cm;日本TaKaRa公司生产的Takara反转录试剂盒（货号：638313）;美国伯乐公司生产的Bio-Rad PCR儀（货号：179203）;赛默飞世尔科技（中国）有限公司生产的SYBR Green Master Mix、BCA试剂盒（货号：23221）;天根生化科技（北京）有限公司生产的RNase-free H2O（货号：RT121-02）、LcDNA（货号：KR202-01）;购自上海联迈生物工程有限公司的ADAM8酶联免疫吸附法（ELISA）试剂盒（货号：10548）、IRF1 ELISA试剂盒（货号：10511）。

1.3 标本采集

入组后晨间抽取各组受试者空腹静脉血6 mL，置入乙二胺四乙酸抗凝管内，通过Ficoll-Hypaque密度梯度离心法将外周血的血清及单个核细胞进行分离，并将血清分装进200 μL的EP管中，置于-70℃冰箱中保存。单个核细胞添加200 μL TRIzol或200 μL蛋白裂解液后，置于-70℃冰箱中保存。

1.4 荧光定量PCR法测定ADAM8、IRF1的mRNA表达

通过TRIzol法将外周血中单个核细胞的总RNA予以提出，并通过Takara反转录试剂盒进行cDNA的合成，其中ADAM8的正向引物为5′-GGGAGAAAC-AACGAAGTTG-3′，反向引物为5′-GGTGTGATCAA-GCACAGAT-3′;IRF1的正向引物为5′-GCGGCACCTGGCGCACGGCT-3′，反向引物为5′-GGTGGCAA-GCACCAAGAC-3′;β-actin的正向引物为5′-GTGA-CGTGGACAATCCGCAAG-3′，反向引物为5′-GGAA-GGTGGACAACGGACGC-3′。反应体系为10 μL，其中含0.5 μL的100 ng/μL cDNA，5 μL的SYBR Green Master Mix，10 μmol/L的正/反向引物各有0.4 μL，3.7 μL的RNase-free H2O。通过Bio-Rad PCR仪实施扩增。设置反应条件：95℃ 2 min，95℃ 15 s，60℃ 30 s，72℃ 20 s，40个循环。通过2-△△Ct法实施数据分析，对每个样品实施3次重复。

1.5 Western blot法测定ADAM8及IRF1蛋白表达

提出外周血内的单个核细胞有关总蛋白，通过BCA试剂盒检测蛋白总量。ADAM8及IRF1单克隆抗体干粉试剂（购自美国的Santan Cruz公司，货号：159472、163108），鼠源性单克隆抗体肌动蛋白（β-actin）及辣根过氧化物酶所标记的羊抗鼠二抗（购自北京中杉金桥生物技术有限公司，货号：257060、203471）。其中一抗的稀释度为1∶500，二抗的稀释度为1∶1000。将β-actin蛋白设置为内参，采用Western blot法测定血清ADAM8蛋白水平及单个核细胞内IRF1蛋白的表达水平，本次实验重复3次，并用Tanon全自动化学发光图像分析系统实时图像采集，对蛋白表达水平实施半定量分析。

1.6 肺功能测定

采用法国迪尔肺功能测定仪检测各组受试者肺功能，所有指标均一次性同步检测，每项检测需重复至少3次，确保数值变化<5%，将最佳值用于数据分析。主要检测指标包含：①第1秒用力呼气容积（FEV1）;②FEV1与用力肺活量的比值（FEV1/FVC）;③呼气峰流速（PEF）[6]。

1.7 统计学方法

采用SPSS 21.0统计学软件进行数据分析，计数资料用率表示，组间比较采用χ2检验;计量资料用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用LSD-t检验;相关性分析采用Pearson法进行。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组外周血ADAM8、IRF1的mRNA及蛋白表达水平比较

观察组的外周血ADAM8、IRF1的mRNA及蛋白表达水平均明显高于对照组，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。观察组各亚组外周血ADAM8、IRF1的mRNA及蛋白表达水平比较，差异均有高度统计学意义（P < 0.01）。观察组各亚组ADAM8、IRF1的mRNA相对表达量及蛋白表达水平均高于对照组，且重度组和中度组高于轻度组，重度组高于中度组，差异均有统计学意义（P < 0.05）。见图1、表1。

2.2 各组肺功能指标的比较

观察组的FEV1、FEV1/FVC及PEF水平明显低于对照组，差异有高度统计学意义（P < 0.05）。观察组各亚组肺功能指标比较，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。观察组各亚组的FEV1、FEV1/FVC及PEF水平低于对照组，且重度组和中度组低于轻度组，重度组低于中度组，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表2。

2.3 患儿外周血ADAM8、IRF1的蛋白表达与其肺功能指标的相关性分析

Pearson相关性分析结果示，患儿外周血ADAM8、IRF1的蛋白表达与其FEV1、FEV1/FVC以及PEF均呈负相关（rADAM8=-0.780、-0.773、-0.682，均P < 0.01;rIRF1=-0.684、-0.710、-0.768，均P < 0.01）。

3 讨论

临床上，BA属于一类十分常见的呼吸系统疾病，其在儿童群体中的发病率较高，且近年来的发病率增高趋势越来越明显。BA患儿通常会表现出呼吸困难、胸闷，以及咳嗽、喘息等诸多症状，且在过敏原刺激等多种因素的诱导下较易产生急性发作的现象，对患儿的日常生活造成了较大的危害[7]。目前认为，在BA患儿疾病进展中，炎症和免疫反应产生了重要的作用[8-9]。患儿呼吸系统在长期炎症的影响下，气道高反应明显加剧，喘息和呼吸困难等症状反复发作，最终可能致使肺部通氣功能障碍，并导致气道狭窄，从而进一步增加治疗难度。目前，临床上治疗BA的药物主要是长效β2激动剂以及皮质类固醇等，虽然具有一定的疗效[10-13]，但对于重度BA的疗效并不显著。因此，寻找新型治疗靶点对于重度BA而言十分必要。近年来大量研究发现，ADAM8和IRF1与机体内的炎症及免疫反应联系紧密，因此分析二者与BA患儿肺功能之间的关系，可能有助于更好地诊治BA[14-15]。

FEV1、FEV1/FVC及PEF为常用的监测肺功能的重要指标，ADAM8和IRF1与免疫炎性反应有关。本研究发现，观察组的FEV1、FEV1/FVC及PEF水平较对照组明显降低，提示BA患儿的肺功能明显下降;而外周血ADAM8、IRF1的mRNA及蛋白表达水平明显升高，分析原因，肺功能的下降主要与患儿的呼吸系统受损有关，ADAM8、IRF1的表达上升提示二者均参与到了BA的发病进程中。ADAM8是分泌性糖蛋白有关金属蛋白酶的家族成员，其在嗜酸/中性粒细胞及巨噬细胞，以及单核细胞等免疫细胞中均可表达，并能调节炎症细胞的迁移过程，还可使炎症细胞自肺部清除，具有一定的抗炎特性[16-18]。然而，ADAM8与气道内的炎症细胞和嗜中性粒细胞聚集过程也存在一定关系，可使炎症细胞逐渐向BA患儿的气道迁移，而高水平的ADAM8表达则可诱导BA形成，最终促进病情的发展。IRF属于转录因子的一种，其主要定位在细胞核，可经干扰素的信号通路（γ-干扰素/Jak/STAT1）有效参与到多种基因的表达过程中，并可参与细胞免疫及细胞分化等病理生理性过程[19-21]。IRF的高表达主要可能通过免疫炎性反应对BA患儿的肺功能产生影响，最终加速了病情的进展。同时，本研究还发现，随着患儿病情的加重，ADAM8和IRF1的表达水平明显升高，而肺功能则明显减弱。进一步发现，患儿外周血ADAM8和IRF1的蛋白表达与其FEV1和FEV1/FVC，以及PEF均呈负相关，提示ADAM8、IRF1的表达与BA患儿的病情进展及肺功能受损密切相关。原因考虑是与ADAM8、IRF1二者通过对B淋巴细胞、单核细胞及树突状细胞等有关免疫细胞和炎性反应的共同调节作用有关。这同时也提示临床上可通过监测ADAM8、IRF1在BA患儿外周血中的表达情况以辅助诊治，在既往的报道[22-24]中也有类似结论。需要指出的是，本次研究也存在一定的不足，比如研究样本比较少、研究涉及面相对较窄，今后可通过邀请同级及上级医疗机构共同开展大样本容量的综合研究，从而获得更具代表性及精准性的研究结论。

综上所述，BA患儿外周血ADAM8和IRF1的表达水平明显升高，且二者与肺功能具有密切的关联，临床上可考虑将二者纳入BA患儿的监测靶点，从而辅助诊治过程。

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（收稿日期：2018-11-16  本文编辑：任   念）