沉香提取液对乙醇致大鼠胃溃疡的保护作用及机制

马麟 张昕 陈焕鑫 周海玲 李嘉琪 王羚郦

[摘要] 目的 研究沉香提取液對胃溃疡组织的保护作用及其作用机制。 方法 将60只SPF级的SD雄性大鼠按随机数字表法分为正常组（不予处理），模型组（等体积生理盐水），阳性对照组（兰索拉唑0.003 g/mL），沉香提取液低（0.4 g/mL）、中（0.8 g/mL）、高（1.6 g/mL）剂量组，给药剂量均为1 mL/100 g，每组10只。灌胃无水乙醇1 mL建立急性胃黏膜损伤模型，阳性对照组和沉香提取液各给药组每天灌胃给药1次，连续7 d。采用免疫组化检测大鼠胃组织中Bcl-2和Bax的含量。采用试剂盒检测大鼠血清中氧化因子微量丙二醛（MDA）的含量以及抗氧化因子超氧化物歧化酶（SOD）、微量还原性谷胱甘肽（GSH）的活性。 结果 与正常组比较，模型组胃组织Bcl-2蛋白表达下降，Bax蛋白表达上升（P < 0.05）。与模型组比较，沉香提取液各给药组Bcl-2蛋白表达明显上升，Bax蛋白表达明显减少（P < 0.05）。与模型组比较，沉香提取液各给药组能有效提高血清中SOD和GSH活性，降低MDA含量（P < 0.05）。 结论 沉香提取液可能通过升高胃组织中Bcl-2蛋白表达、减少Bax蛋白表达、提高血清中SOD和GSH活性、降低MDA含量来改善无水乙醇致大鼠的胃溃疡。

[关键词] 沉香;抗胃溃疡;免疫组化;作用机制

[中图分类号] R737.14          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-7210（2019）08（c）-0015-04

[Abstract] Objective To study the protective effect of Chinese eaglewood extract on gastric ulcer tissue and its mechanism. Methods Sixty SPF Sprague-Dawley （SD） male rats were divided into normal group （not to deal with）， model group （equal volume of normal saline）， positive control group （Lansoprazol 0.003 g/mL）， Chinese eaglewood extract low （0.4 g/mL）， medium （0.8 g/mL） and high （1.6 g/mL） dose groups by random number table method， the dosage of each group was 1 mL/100 g， with 10 rats in each group. The acute gastric mucosal injury model was established by intragastric administration of anhydrous ethanol 1 mL. The positive control group and Chinese eaglewood extract groups were given intragastric administration once a day for 7 days. The contents of Bcl-2 and Bax were examined by immunohistochemical method. The kit was used to detect the content of oxidative factor malondialdehyde （MDA） and the activity of antioxidant factor superoxide dismutase （SOD） and trace reduced glutathione （GSH） in rat serum. Results Compared with the normal group， the expression of Bcl-2 protein in the gastric tissue of the model group decreased， and the expression of Bax protein increased （P < 0.05）. Compared with the model group， the expression of Bcl-2 in the gastric tissue of Chinese eaglewood extract groups increased， and the expression of Bax protein decreased （P < 0.05）. Compared with the model group， the activity of SOD and GSH of Chinese eaglewood extract groups increased and the content of MDA decreased （P < 0.05）. Conclusion Chinese eaglewood extract can improve the gastric ulcer induced by absolute ethanol through increasing the expression of Bcl-2 protein in gastric tissue， reducing the expression of Bax protein， improving the activity of serum SOD and GSH and decreasing the content of MDA.

[Key words] Chinese eaglewood; Anti gastric ulcer; Immunohistochemistry; Mechanism

沉香为瑞香科植物白沉香Aquilaria sinensis（Lour.）Gilg含有树脂的木材[1]。中医学理论认为沉香具有行气止痛、纳气平喘、温中止呕的作用，归胃经，临床上治疗胃痛、腹痛、呕吐等症状。该药材含有黄酮类、酚类等多种活性成分，其质量标准收载于《中国药典》2015年版一部[2]。其中，沉香在临床应用上具有保护消化系统和中枢神经系统等药理作用[3-5]。消化性溃疡是由于侵袭因子（Hp感染、胃酸和胃蛋白酶作用、非甾体类抗炎药等）与防御因素（胃黏液-重碳酸盐屏障、黏膜屏障、黏膜血流因素等）之间平衡失调所致，其是一个世界性范围的胃肠道疾病，对人类健康危害极大[6]。尽管沉香在消化系统上的应用较多，但目前沉香对消化系统的作用机制尚不明确[7]。因此，进一步深入探究沉香药理作用及其作用机制，对扩大其临床应用范围具有深远意义。本研究通过建立无水乙醇实验性溃疡的动物模型，利用免疫组化测定胃组织中Bcl-2和Bax蛋白的表达，相应试剂盒测定血清中氧化及抗氧化因子水平，旨在研究沉香提取液对胃溃疡组织的保护作用及其作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级雄性SD大鼠（体重180～200 g，49～56日龄）60只，购自广东省实验动物中心，质量合格证号为44007200046214。大鼠饲养于SPF级动物房，实验前适应性喂养7 d，垫料每日更换1次，自由摄食和饮水，动物房保持室内温度20～26℃，相对湿度为40%～60%，每日光照12 h。在给药前12 h开始禁食，自由饮水;造模前12 h，大鼠只禁食不禁水，造模给药前称重。

1.2 主要仪器与试剂

1.2.1 实验试剂  95%乙醇（色谱级，天津市大茂化学试剂厂）;甲醇（色谱级，天津市福晨化学试剂厂）;兰索拉唑肠溶片（汕头经济特区鮀滨制药厂，批号：1010598750）;水合氯醛（天津市科密欧化学试剂有限公司，批号：5115259）;大鼠Bax和Bcl-2抗体免疫组化试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司生产，批号分别为C10099370、C10099867）;微量丙二醛（MDA）试剂盒（批号：1170091）、超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒（批号：1162017）、微量还原性谷胱甘肽（GSH）试剂盒（批号：1132501）均购于南京建成生物工程研究所。

1.2.2 实验仪器  岛津AUY120分析天平（精确度0.000 01）;赛默飞HistoSta组织包埋机;赛默飞STP120组织脱水机;赛默飞Gemini AS自动染色机;赛默飞HM340E石蜡切片机;奥林巴斯BX53荧光显微镜。

1.3 方法

1.3.1 实验分组及给药  将60只雄性SD大鼠[体重（180±20）g]按随机数字表法分为六组，即正常组（不予处理），模型组（给予1 mL/100 g生理盐水），阳性对照组（给予兰索拉唑浓度为0.003 g/mL，给药剂量为1 mL/100 g），沉香提取液低、中、高剂量组（浓度分别为0.4、0.8、1.6 g/mL，给药剂量为1 mL/100 g）。

1.3.2 实验前处理  除正常组外，其余各组每只大鼠灌胃无水乙醇1 mL造成急性胃黏膜损伤，之后阳性对照组和沉香提取液各给药组每天灌胃给药1次，模型组给予同等剂量生理盐水，连续7 d，于最后1次给药1 h后，麻醉，腹主动脉取血5 mL，静置2 h，离心10 min（r = 6 cm），血清保存于-80℃待用。再腹腔取大鼠胃组织，沿胃大弯剪开胃，清洗胃组织后，切取适量体积胃组织，装入甲醛溶液中保存，待制片。

1.3.3 取材與固定  准确地取胃组织块解剖部位体积2.0 cm×2.0 cm×0.3 cm，用水冲洗干净组织块上的污物，再放入配置好的固定液中，标本与固定液的比例为1∶4～1∶20，适当的体积有利于样品的观察及固定液的渗透和染液的渗透。

1.3.4 脱水透明  标本经过固定和冲洗后，组织中含有较多的水分，先后以80%、90%、95%、100%乙醇各洗脱2 h。本次实验使用的透明剂是二甲苯。

1.3.5 浸蜡、包埋  将石蜡浸入组织中，取代组织中含有的透明剂，浸入的时间稍微延长一些，使石蜡尽可能地浸入组织中;浸蜡后置于融化的固体石蜡中，待凝固后修齐蜡块，固定于木块上，包埋完成。

1.3.6 切片和贴片  主要步骤：修整蜡块、准备好切片用具、安装蜡块、安装切片刀（控制切片厚度为4～6 μm）、切片、铺片、贴片，最后置入60～65℃恒温箱内中烘片2 h，脱去溶化组织间隙的石蜡，封片。

1.3.7 样品的免疫组化处理  切取固定的胃组织，分别进行脱水、石蜡包埋、切片、载片、烘片、脱蜡，之后按免疫组化试剂盒的说明书步骤灭活内源性酶、滴加消化液、山羊血清封闭液、生物素、SABC，最终用DAB显色、苏木精复染、脱水、封片即得。所得到的切片运用image pro plus分析软件分别计算切片的染色面积（IOD），并以每个切片的平均染色面积（IOD/Area）为最终结果进行统计学分析。

1.3.8 大鼠血清中GSH、SOD、MDA水平的测定  根据试剂盒说明书步骤，分别设置空白孔、标准品孔和样本孔，标准品孔和样本孔中按步骤先后加入过氧化物酶标记的检测抗体、洗涤液、底物、终止液等。最后在450 nm波长处测定各孔OD值，根据说明书公式，将OD值换算成最终的GSH、SOD和MDA的浓度并进行统计学分析。

1.4 统计学方法

运用统计学软件SPSS 20.0分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组比较采用单因素方差分析，若组间差异有统计学意义，则行进一步两两比较，采用LSD-t检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠胃组织中Bcl-2、Bax蛋白表达水平比较

单因素方差分析结果显示，各组大鼠胃组织中Bcl-2、Bax蛋白表达水平比较，差异均有统计学意义（P < 0.05）。进一步两两比较，与正常组比较，模型组中胃组织Bcl-2蛋白表达降低，Bax蛋白表达升高，差异均有统计学意义（P < 0.05）。与模型组比较，沉香提取液各给药组Bcl-2蛋白表达明显升高（P < 0.05），染色面积较大，其中高剂量组中Bcl-2蛋白表达优势最明显;Bax蛋白表达明显降低（P < 0.05），染色面积较小，且随着给药剂量的增加而逐步减少。见表1。

2.2 各组大鼠血清中GSH、SOD活性和MDA含量比较

单因素方差分析结果显示，各组大鼠血清中GSH、SOD活性和MDA含量比较，差异均有统计学意义（P < 0.05）。进一步两两比较，与正常组比较，模型组GSH、SOD活性显著下降，MDA含量明显增加，差异均有统计学意义（P < 0.05）;与模型组比较，沉香提取液各给药组GSH、SOD活性均显著升高（P < 0.05），MDA含量显著降低（P < 0.05），且呈现剂量依赖关系。见表2。

3 讨论

免疫组化是一种方法学，由最初的免疫荧光直接标记法逐步出现了间接法、免疫酶法、亲和细胞化学方法、免疫胶体金法、多聚物酶法（或称非生物素放大法）、CSA法、酶标记荧光法和原位免疫PCR法及循环放大（RCA）法等。该技术具有高度特异性，通过抗原抗体反应及呈色反应，可在组织和细胞中进行抗原的准确定位，因而可同时对不同抗原在同一组织或细胞中进行定位观察，这样就可以进行形态与功能相结合的研究，对病理学领域开展深入研究十分有意义[8-9]。

在本研究中，决定胃黏膜细胞凋亡的蛋白Bax、Bcl-2存在着一定的联系。当发生溃疡时，促凋亡基因Bax与抗凋亡基因Bcl-2失衡[10-11]，而沉香提取液能显著提高胃黏膜Bcl-2蛋白表达，同时降低Bax蛋白表达，使两种蛋白恢复动态平衡，从而达到修复溃疡的目的[12-13]。本研究中，模型组胃组织Bcl-2表达减少，Bax蛋白表达增多（P < 0.05）;与模型组比较，沉香提取液低、中、高剂量组胃组织中Bcl-2蛋白明显升高（P < 0.05），其中，沉香提取液高剂量组Bcl-2蛋白表达优势最明显，沉香提取液低、中、高剂量组Bax蛋白表达降低（P < 0.05），且随着给药剂量的增加而逐步减少。

研究表明，脂质过氧化反应和氧自由基贯彻了慢性胃炎、胃溃疡和胃癌等疾病的整个发病历程，与消化性疾病息息相关[14]。机体胃组织布满了血管，有着充足的供血，当胃组织受到外来物质刺激或条件应激时，可产生大量氧自由基，这些物质能诱导细胞发生调亡，加重胃黏膜损害[15]，而脂质过氧化水平常用于评价自由基产生水平及胃黏膜组织损伤的严重程度。SOD是存在于机体中的抗氧化剂，能够清除体内产生的氧自由基，降低由于氧自由基所带来的对细胞的伤害，同时还能修复受损细胞[16]。因此，SOD常用于考察清除氧自由基能力和胃黏膜保护作用[17]。MDA是脂质氧化反应中产生的过氧化物，氧自由基引起多不饱和脂肪酸的脂质过氧化是其导致胃黏膜细胞损伤的重要因素[18]。胃组织中MDA的水平可以侧面反映组织受氧化损伤的严重程度，MDA是胃黏膜的攻击因子[19-20]。

本研究通过无水乙醇应激诱导大鼠，建立急性实验性胃溃疡模型，利用沉香提取液进行药物干预，利用免疫组化检测Bax、Bcl-2蛋白的变化趋势，探究沉香提取液对于预防溃疡的机制。同時测定不同组别的大鼠氧化和抗氧化因子SOD、GSH、MDA的含量变化，初步探讨沉香提取液对溃疡组织的保护作用及可能机制。实验结果提示，沉香提取液对无水乙醇所致胃溃疡有一定的保护作用。

然而，本研究只限于评价沉香提取液对无水乙醇所致的急性胃损伤的保护作用，而关于其是否对慢性炎症或其他胃攻击因子造成的胃黏膜损伤模型具有保护作用仍有待进一步的研究。因此，今后可通过建立各种炎症和胃溃疡模型对本文所获得的结论加以印证，以便更全面地评价沉香提取液抗胃溃疡活性，为沉香的临床治疗胃溃疡提供理论指导。

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（收稿日期：2018-12-07  本文编辑：张瑜杰）