基于色谱-质谱技术分析高湿条件下霉变黑毛茶品质成分变化及真菌毒素残留

胥 伟，姜依何，田双红，朱 旗,*

（1.湖南农业大学茶学教育部重点实验室，湖南 长沙 410128；2.四川农业大学园艺学院，四川 成都 611130）

黑茶初制生产工序历经杀青、揉捻、渥堆和干燥，由此将茶树鲜叶制得黑毛茶[1]，黑毛茶再通过筛分、轧切、风选、拼堆、蒸压、发花等精制工序加工成不同品质风格的黑茶产品。中国茶叶流通协会报道了2018年全国黑茶产量为31.89万 t，占比六大茶类总量的12.20%，位居六大茶类第2位[2]。由于生产黑茶的鲜叶原料采摘通常较为粗老，加工成的黑毛茶需在库房中存放1～2 a才能进行精制[3]，同时，售出的黑茶商品，消费者通常将其存放一段时间以改善其粗涩的口感。在黑毛茶或成品黑茶贮存过程中，如果遇到高湿高温的环境条件，特别是南方的梅雨季节，茶叶表面则极易滋生霉菌[4-5]，轻者有风霉味，重者失去饮用价值[6]，甚至产生安全问题。

从有关黑茶微生物群落构成的研究成果看，正常生产上暂未发现黄曲霉菌株的报道[7]。但从外源接种的角度看，黄曲霉可在潮水或回潮的茶叶样本上生长[8-11]。赭曲霉素A是一类重要的广泛存在于食品和饲料中的真菌毒素[12]，赭曲霉毒素最初从赭曲霉代谢产物中发现[13]，进一步研究表明曲霉属（Aspergillus）和青霉属（Penicillium）真菌[14]均产生该类具有致癌、致畸、致免疫抑制、致肝脏毒性及严重肾毒性的次生代谢产物[15-16]。脱氧雪腐镰刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON），俗称“呕吐毒素”，主要是一类由禾谷镰刀菌和黄色镰刀菌产生[17]的能够引起动物或人类呕吐、腹泻甚至肠道坏死的次生代谢产物[18]，而呕吐毒素因其具有明显的急性致呕作用而在相关研究中常被报道[9]。

为了解高湿条件下霉变给黑毛茶品质带来的影响，本研究人工设定温度和相对湿度环境促进霉菌在黑毛茶上生长，通过高效液相色谱法及液相色谱-串联质谱法测定黑毛茶霉变过程中多种品质化学组分及3 种真菌毒素的含量，为高湿霉变导致黑毛茶品质劣变的发生规律提供相关依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

将来源于黑茶生产企业的黑毛茶（2016年5月产于湖南省桃源县，一级，含水量（10.05±0.20）%）样品盛于培养皿（培养皿开口，每份培养皿15 g茶样，分别置于培养箱内5 层栅状隔板上，每层12 份，合计60 份），并置于生化培养箱进行促霉培养。培养条件：温度25 ℃，相对湿度90%。

人工促霉培养过程中分别按培养至第0、5、7、9、11、13、15天依照栅状隔板分层取样混匀，-20 ℃密封冻存。

从市场收集2 份自然霉变黑茶样品（霉变茯砖茶：ZM1，霉变花卷茶：ZM2）用于真菌毒素的对照分析。

1.2 仪器与设备

GZ-150-HSII恒温恒湿箱 韶关市广智科技设备有限公司；PB303-N电子天平 梅特勒-托利多仪器有限公司；LDP-350型高速多功能粉碎机 浙江永康市红太阳机电有限公司；XMTD-7000恒温水浴锅箱 上海精宏实验设备有限公司；N13462C移液器 德国Eppendorf公司；KQ3200B超声波清洗器 昆山超声仪器有限公司；UV-2550紫外-可见分光光度计、LC-20AT高效液相色谱仪 日本岛津公司；ACCQ·TagTM氨基酸分析色谱柱（3.9 mm×150 mm，5 μm） 美国Waters公司；ECOSIL-C18色谱柱（4.6 mm×150 mm，5 μm） 广州绿百草科学仪器有限公司；R-300旋转蒸发仪 瑞士Büchi公司；1290-6460液相色谱-串联质谱仪 美国Agilent公司；Aquelix 5超纯水制备仪 美国Millipore公司；35R超速离心机 德国Rotina公司；3001型酶标仪美国Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1 茶汤制备

准确称取粉碎茶样5.0 g于500 mL三角瓶中，加沸腾蒸馏水450 mL，沸水浴浸提45 min，过滤，洗涤残渣，滤液合并于500 mL容量瓶中，冷却后定容，摇匀，待测。测定前待测样过0.45 μm滤膜，取滤液上机待测。

1.3.2 水分及多酚总量测定

水分含量测定参考GB 5009.3—2016《食品中水分的测定》[19]；茶多酚含量测定参考GB/T 8313—2008《茶叶中茶多酚和儿茶素类含量的检测方法》[20]。

1.3.3 高效液相色谱分析

儿茶素组分、嘌呤碱、游离氨基酸含量及没食子酸含量测参考刘建军等[21]的方法。

儿茶素及嘌呤碱含量测定色谱条件：ECOSIL-C18色谱柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；检测波长200 nm；进样量10 μL；柱温40 ℃；流速1.0 mL/min；流动相A为超纯水，流动相B为40% N,N-二甲基甲酰胺溶液溶液。梯度洗脱程序：0.01 min，9% B；10 min，14% B；15 min，23% B；27 min，36% B；31 min，36% B；32 min，9%B；37 min，停止。

给出一个训练集Τ={(xi,yi),i=1...l}，其中xi∈RN,yi∈R，在特征空间F 中构造一个线性回归方程：

游离氨基酸组分色谱条件：ACCQ·TagTM色谱柱（3.9 mm×150 mm，5 μm）；检测波长220 nm；进样量20 μL；柱温37 ℃；流速1.0 mL/min；流动相A为10% ACCQ·TagTM洗脱液，流动相B为60%乙腈溶液。梯度洗脱程序：0.01 min，0% B；0.5 min，2% B；15 min，7% B；19 min，10% B；32 min，33% B；34 min，100% B；37 min，100% B；39 min，0% B；42 min，0% B；42.01 min，停止。1.3.4 液相色谱-串联质谱检测

1.3.4.1 试样制备

称取2.0 g茶样于50 mL离心管中，加入内标物玉米烯酮（10 μg/kg）和DOM-1（25 μg/kg）。加入10 mL乙酸乙酯-甲酸（99∶1，V/V）溶液，振摇30 min。3 200×g离心15 min。上清液定容到10.0 mL。取2.0 mL于试管中，氮吹近干再用1.0 mL乙腈-水（84∶16，V/V）复溶，这部分提取液称为“提取液1”。剩下8.0 mL提取液（提取液2）通过200 mg/3 mL的NH2固相萃取柱（用3 mL乙酸乙酯-甲酸（99∶1，V/V）溶液活化），过滤液收集于试管中，NH2柱抽干10 min，过滤液氮吹近干，然后用2.0 mL乙腈-水（84∶16，V/V）复溶并通过500 mg/6 mL C18固相萃取柱（用5 mL乙腈-水（84∶16，V/V）活化）。提取液2通过C18柱后，提取液1也通过同一根C18柱。两部分过滤液都收集于试管中，C18固相萃取柱抽干10 min，过滤液氮吹近干，然后用100 μL流动相水-甲醇（60∶40，V/V）和0.3%甲酸溶液复溶。14 000×g离心15 min，然后上机测定[22]。

1.3.4.2 液相色谱-串联质谱测定条件

液相色谱条件：柱温60 ℃；进样量10.0 μL；流动相A为0.3%甲酸溶液，流动相B为甲醇-0.3%甲酸溶液；流速0.55 mL/min；洗脱程序：0～1 min，0% B；1～1.5 min，0%～15% B；1.5～8 min，15% B；8～8.5 min，15%～30% B；8.5～11 min，30%～40% B；11～12 min，40% B；12～14 min，40%～55% B；14～16 min，55% B；16～19 min，55%～85% B；19～20 min，85%～100% B；20～22 min，100% B；22～23 min，100%～0% B；23～25 min，0% B。

质谱条件：电喷雾离子源，正离子模式，温度120 ℃；脱溶剂温度400 ℃；毛细管电压3.2 kV；碰撞气体为氩气；锥氮和脱溶剂气流50～800 L/h。在每个分析物的前体离子选择之后，产物离子与锥孔电压和碰撞能相结合。为提高灵敏度和选择性，在选定的反应监测中进行数据采集。离子化质荷比分别为：AFB1：母离子m/z313.0，子离子m/z241.0、269.0；赭曲霉毒素A（ochratoxin A，OTA）：母离子m/z404.0，子离子m/z358.0、239.0；DON：母离子m/z297.0，子离子m/z249.0、203.3。

1.4 数据统计

采用Microsoft Excel 2007软件和SPSS 22.0软件进行数据统计分析。

2 结果与分析

2.1 黑毛茶霉变过程氨基酸组分变化

表1 氨基酸组分含量Table 1 Changes in amino acid composition during incubation of raw black tea at high humidity

氨基酸是茶汤呈味物质的主要构成之一，口感主要体现为鲜爽味，氨基酸含量的高低对茶汤鲜爽味的呈现起着很大的作用。如表1所示，氨基酸总量随着霉变时间的延长而逐渐降低，在霉变之初0～5 d降低最快，降低率约为80.23%。茶氨酸为测定的18 种游离氨基酸组分中含量最高的一类氨基酸，未霉变时约占游离氨基酸总量的40.92%。在未霉变黑毛茶样本中，含量前5的氨基酸组分为茶氨酸、精氨酸、谷氨酸、天冬氨酸和蛋氨酸，霉变第15天时排名前5的氨基酸组分为茶氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸。精氨酸和蛋氨酸含量在霉变过程中降解速度很快，说明精氨酸较容易成为霉菌的氮源而被霉菌所利用转化。在18 种氨基酸组分中仅酪氨酸含量略有增加，未见因霉菌生化代谢转化而导致某类氨基酸含量明显上升的现象。采用最小显著性差异法对茶氨酸和18 种氨基酸总和在不同霉变时期的含量进行差异显著性分析。结果表明：茶氨酸从霉变起始至霉变第5天时含量变化呈显著性差异（P＜0.05）；18 种氨基酸总量从霉变起始到霉变第7天时含量变化呈显著性差异，霉变第9～15天含量变化呈现显著性差异。

2.2 黑毛茶霉变过程嘌呤碱组分变化

表2 嘌呤碱组分含量Table 2 Changes in contents of purine alkaloids during incubation of raw black tea at high humidity

茶树中的嘌呤碱主要为3 类：咖啡碱（1,3,7-三甲基黄嘌呤）、茶叶碱（1,3-二甲基黄嘌呤）、可可碱（3,7-二甲基黄嘌呤），是茶汤呈味物质的主要构成之一，口感主要体现为苦味。如表2所示，嘌呤碱总量在霉变起始阶段（0～7 d）中的变化存在显著性差异，而且表现出上升的趋势。这可能与霉变起始阶段其他内含成分降低迅速而嘌呤碱化学性质稳定不易被霉菌利用有关。霉变第9～15天，嘌呤碱总量基本保持稳定，无显著性差异。茶碱霉变第9～15天呈显著性差异，呈现上升趋势，而这种上升的趋势与咖啡碱的下降趋势又表现出相对应的数量关系，这表明茶碱的变化主要由咖啡碱转化而来。嘌呤碱总量随着霉变时间的延长而表现出先升高后稳定的规律，同时也说明霉菌生长所利用的氮源主要来源于氨基酸，而嘌呤碱的利用度较小。

2.3 黑毛茶霉变过程儿茶素组分及多酚含量变化

表3 儿茶素组分及多酚含量Table 3 Changes in contents of catechins and polyphenols during incubation of raw black tea at high humidity

茶多酚类物质是茶叶的主要呈味品质成分，本研究测定茶叶中主要存在的几类儿茶素及没食子酸，观察霉变过程儿茶素组分的变化情况。如表3所示，EGC含量由起始的16.19 mg/g下降至6.26 mg/g；EGCG含量则由起始的31.51 mg/g下降至15.28 mg/g。而没食子酸含量也相应有所降低，由起始的1.66 mg/g降低至0.96 mg/g；EC、DL-C及GCG含量则变化不大。茶多酚总量在促霉培养前5 d下降速度较快，由126.01 mg/g降低至110.18 mg/g（第5天检出数据显示与第0天呈显著性差异），表明多酚类物质在霉菌侵染的过程中能够被转化吸收利用于霉菌自身代谢。从霉变起始至霉变第5天，无论是儿茶素组分还是多酚总量均表现出显著性差异，呈现降低规律。而茶多酚总量从霉变第5天开始，随着霉变时间的延长而不再表现显著性降低趋势。表明霉菌在霉变起始利用多酚类物质做为碳源最为剧烈，随着霉菌的生长，开始向其他类物质摄取碳源物质。

2.4 霉变黑毛茶霉变过程3 种真菌毒素含量测定结果

图1 3 种真菌毒素标准品色谱-质谱图Fig. 1 Chromatograms and mass spectra of three mycotoxin standards

有学者采用酶联免疫方法检测黑茶中的真菌毒素[23-25]，但本研究前期实验表明，由于黑茶茶色素的干扰导致酶联免疫技术不适用于黑茶样品的真菌毒素检测，与相关文献研究结论一致[26-28]。故采用液相色谱-串联质谱技术研究霉变过程中AFB1、OTA和DON在霉变黑茶样本及霉变过程中的存在情况。

如图1和表4所示，测定的霉变黑茶样品中OTA、DON、AFB13 种真菌毒素均未检出（或低于检出限），表明上述3 种真菌毒素并非广泛存在于黑茶样品中。而外源接种黄曲霉菌株（ACCC30899）的阳性对照黑毛茶样品中检出的AFB1含量为12.98 μg/kg，表明外源污染的真菌种类是导致霉变黑毛茶残留真菌毒素的主要诱因。

表4 3 种真菌毒素含量Table 4 Changes in contents of three mycotoxins during incubation of raw black tea at high humidity

3 讨 论

黑茶品质化学多集中于品质形成机理研究，但对于高湿霉变环境引起的黑茶品质劣变的研究较少。本研究从高湿条件下诱导黑毛茶的霉变过程着手，模拟梅雨季节的贮藏条件，研究霉变黑毛茶的主要品质成分变化规律及真菌毒素残留状况。

黑毛茶霉变过程中，氨基酸和儿茶素类物质在霉变初期（第0～5天）含量下降迅速，其中茶氨酸作为18 种游离氨基酸组分中含量最高的氨基酸，其含量的变化是霉变过程黑毛茶氨基酸下降的主要原因，实验过程未检测到因霉菌生化代谢转化而导致某类氨基酸含量明显上升的现象。从霉变起始至霉变第5天，茶氨酸和18 种氨基酸总量分别下降了71.65%和78.67%，至霉变第15天时，其含量仅为起始含量的12.31%和13.95%。表明霉变过程对黑茶品质带来了极大的影响。3 种嘌呤生物碱的总量在霉变过程中基本保持稳定，茶碱在霉变过程中有所上升，而咖啡碱则有所下降，两者存在数量相关性，其原因可能在于部分霉菌存在嘌呤碱之间的转化能力[29]。儿茶素类组分主要以EGCG和EGC的含量降低为主，不含没食子酸基团的儿茶素（EC、DL-C）和非表型儿茶素（GCG）含量变化不大。这表明，霉菌存在水解儿茶素没食子基团的能力，这在单体物质代谢研究中已经被证明[30-31]，但这种能力是否还受制于儿茶素的构型，有待进一步实验证明。茶多酚和没食子酸含量在霉菌侵染的过程中逐渐降低，表明该类物质能够被霉菌所代谢和转化，具体的代谢转化机制及通路有待进一步研究。

本实验采用液相色谱-串联质谱技术研究霉变黑毛茶样品中OTA、DON、AFB13 种真菌毒素，结果表明上述3 种真菌毒素并非广泛存在于黑茶样品中，而阳性对照样品的检出结果则说明了外源污染真菌种类可能是导致黑茶霉变产生真菌毒素的主要原因，生产上需要严格防范；高湿霉变条件下，多种茶叶有效成分降低，导致黑毛茶品质的下降，因此贮存环境的控制是保持黑毛茶品质的重要因素。与此同时，除防范生产过程导致的安全问题外，如若在霉变过程中发生了有害真菌的污染，高湿霉变也会导致黑毛茶品质的安全问题，高湿条件的霉变和产毒真菌的污染，应引起黑茶生产企业的高度重视。

4 结 论

高湿条件下，黑茶霉变迅速，多种内含成分在霉变起始至霉变第5天时表现出显著性降低趋势。霉变起始阶段，霉菌利用黑茶品质成分用于自身碳代谢和氮代谢，氨基酸组分、18 种氨基酸总量、儿茶素组分及多酚总量均在霉变第5天时表现出显著性降低趋势。嘌呤碱化学性质稳定，含量表现出先上升后维持稳定的规律，霉变第9～15天时，茶碱含量的上升与咖啡碱含量的下降表现出对应的数量关系，表明霉菌存在将咖啡碱转化成茶碱的生化机制。

酶联免疫测试黑茶真菌毒素时，存在假阳性结果，不适用于黑茶真菌毒素的检测。黑茶霉变过程中，有害霉菌污染可导致黑茶真菌毒素残留。生产上，要严格保障仓储环境，杜绝高湿条件下茶叶霉变产生真菌毒素残留的食品安全问题。