东北6 种红树莓叶酚类化合物的鉴定及抗氧化活性分析

贾仕杰，张海华，张 焕，刘 畅，陈思睿，唐琳琳，王金玲,4,*

（1.东北林业大学林学院，黑龙江 哈尔滨 150040；2.黑龙江省标检产品检测有限公司，黑龙江 哈尔滨 150000；3.黑龙江省谱尼测试科技有限公司，黑龙江 哈尔滨 150040；4.黑龙江省森林食品资源利用重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150040）

红树莓（Rubus ideaus L.）属蔷薇科悬钩子属，俗称覆盆子、托盘等。红树莓在世界温带范围内被广泛种植[1]，我国东北地区是红树莓的主产区，资源丰富，种植历史久，规模大，品种多。在过去的20 a中，树莓和其他小浆果的产量不断增长，市场也在不断扩大[2]。然而红树莓叶的利用程度没有红树莓果实高，仅有少数制成茶叶或用于医药用途，并未得到充分的利用[3-4]。近年来植物丰富的多酚类物质已成为目前研究的热点[5]。旷慧等[6]对红树莓多酚的组分构成进行分析并通过脂质过氧化实验证明其具有良好的抗氧化活性。有研究表明树莓叶中的酚类物质含量较高，可作为天然的抗氧化剂来源[7]。

植物叶片中的酚类物质还被认为是各种饮料和加工食品中的功能性成分，并因其健康相关性质成为研究热点[8-9]。Teleszko等[10]研究发现在浆果类植物中，叶片中的酚类物质明显高于果实，与水果相比叶片具有更高的抗氧化能力。Han Na等[11]研究了树莓叶乙醇提取物的抗血栓作用，结果表明从树莓叶中分离出的山柰酚、槲皮素和银锻苷3 种物质对血浆复钙时间有着明显的延迟作用。Asmita等[12]通过大鼠实验证明树莓叶中的活性物质是通过特异性作用或受体介导途径来调节平滑肌松弛度。

本研究对东北地区6 种不同品种的红树莓营养叶片的活性物质和抗氧化活性进行研究并通过超高效液相色谱-串联质谱（ultra performance liquid chromatographytandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）法对其中的多酚进行定性定量分析，丰富树莓研究相关数据，并为进一步开发和利用树莓资源、提高树莓附加值提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

欧洲红、澳洲红、红宝石、秋福、哈瑞泰兹、杜拉明6 种红树莓叶片均采自黑龙江省农业科学院园艺分院试验田，2018年8月19日采茎尖第5～10片叶，密封冷藏避光运回东北林业大学食品科学实验室冻藏。

标准品：芦丁、槲皮苷、金丝桃苷、绿原酸、鞣花酸、异鼠李素、表儿茶素、儿茶素、丁香酸、没食子酸、阿魏酸、咖啡酸、木犀草素（均为色谱纯，纯度≥98%） 上海源叶生物科技有限公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

722S分光光度计 上海光谱仪器有限公司；FA2004电子天平 常熟市意欧仪器仪表有限公司；DHG-9030A电热恒温鼓风干燥箱 巩义市予华仪器有限责任公司；PHS-3E型pH计 上海仪电科学仪器股份有限公司；超声波清洗机 昆山市超声仪器有限公司；6470液相色谱-质谱联用仪（配有电喷雾离子源，Mass Hunter数据处理系统） 美国安捷伦公司。

1.3 方法

1.3.1 红树莓叶中活性成分含量测定

1.3.1.1 红树莓叶片水分含量

参照GB 5009.3—2016《食品中水分的测定》测定6 种树莓叶片中的水分活度，根据红树莓叶水分活度折算成每克红树莓叶干质量的活性物质含量及抗氧化活性能力。

1.3.1.2 样品提取

红树莓叶解冻后研磨成匀浆，精确称取5.00 g匀浆液加入50 mL含0.1%乙酸的甲醇溶液超声提取1 h。将提取物于4 ℃黑暗环境中放置24 h，过滤并收集上清液（以上程序重复3 次）。在40 ℃条件下减压旋转蒸发馏分物质，合并馏分，用60%甲醇溶液定容至100 mL容量瓶中。用于酚类化合物分析和抗氧化评价[13]。

1.3.1.3 福林-酚法测定总酚含量

参考Pantelidis等[14]的方法测定。以没食子酸为标准品，没食子酸质量浓度（mg/mL）为横坐标，765 nm波长处吸光度为纵坐标。其线性回归方程为y=8.850 3x＋0.011 1（R2=0.999 1）。总酚含量根据红树莓叶含水量折算成每克红树莓叶干质量含总酚的质量（mg/g）。

1.3.1.4 硝酸铝比色法测定总黄酮含量

参考张海悦等[15]的方法测定。以芦丁为标准品，芦丁质量浓度（mg/mL）为横坐标，510 nm波长处吸光度为纵坐标。其线性回归方程为y=1.022 9x＋0.000 3（R2=0.999 2）。总黄酮含量根据红树莓叶含水量折算成每克红树莓叶干质量含总黄酮的质量（mg/g）。

1.3.1.5 香草醛-硫酸法测定原花青素含量

参考孙芸等[16]的方法测定。以儿茶素为标准品，儿茶素质量浓度（mg/mL）为横坐标，500 nm波长处吸光度为纵坐标。其线性回归方程为y=1.695 7x-0.001 0（R2=0.999 4）。原花青素含量根据红树莓叶含水量折算成每克红树莓叶干质量含原花青素的质量（mg/g）。

1.3.2 红树莓叶的抗氧化能力测定

1.3.2.1 铁离子还原能力（ferric reducing antioxidant power，FRAP）测定

参考Benzie等[17]的方法测定。以VC作阳性对照。红树莓叶片提取物采用恒质量法确定样品质量浓度进行适当稀释。通过比较不同红树莓叶片提取物中加入FRAP工作液后的吸光度大小，分析其FRAP强弱。

1.3.2.2 1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除能力测定

参考孙丽萍等[18]的方法测定，稍有改动。在100 μL样品中依次加入0.1 mmol/L的DPPH-乙醇溶液4 mL，避光反应30 min，以去离子水为参比，在517 nm波长处测定吸光度（A1）；用等体积无水乙醇代替DPPH溶液，测定吸光度（A2），用等体积无水乙醇代替样品，测定吸光度（A3）。VC为阳性对照。DPPH自由基清除率按式（1）计算：

1.3.2.3 2,2’-联氮-双-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸二铵盐)（2,2’-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline- 6-sulphonate)，ABTS）阳离子自由基清除能力测定

参考王振宇等[19]的方法测定，稍有改动。在100 μL样品中加入ABTS溶液9 mL，避光反应6 min后，在734 nm波长处测定吸光度（Ai）；用等体积水代替ABTS溶液，测定吸光度（Aj），用等体积无水乙醇代替样品，测定吸光度（A0）。VC为阳性对照。ABTS阳离子自由基清除率按式（2）计算：

1.3.3 红树莓叶中活性成分与抗氧化能力相关性分析

采用Pearson法对红树莓叶中总黄酮、总酚、原花青素与3 种抗氧化能力的相关性进行分析。

1.3.4 红树莓叶中多酚类物质的UPLC-MS/MS鉴定

1.3.4.1 样品前处理

取1 mL提取液经0.45 μm微孔滤膜后转移至进样小瓶，用于UPLC-MS/MS分析。

1.3.4.2 单点外标法标准溶液配制

准确称取10.00 mg标准品，置于10 mL容量瓶中，用甲醇-二甲亚砜（90∶10，V/V）溶液溶解至刻度，摇匀，经0.45 μm微孔滤膜过滤，制成1.0 mg/mL溶液作为对照溶液。在相同测定条件下，以标准品质量浓度为对照计算红树莓叶中目标物质的绝对质量浓度。

1.3.4.3 色谱条件

色谱柱为Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18（3.0 mm×50 mm，1.8 μm）；流动相为A为0.1%甲酸溶液，流动相B为乙腈；流速0.3 mL/min；柱温40 ℃；进样量5 μL。梯度洗脱程序：0～0.5 min，0%～90% A；0.50～2.00 min，90%～10% A；2.00～4.00 min，10% A；4.00～4.10 min，10%～90% A；4.10～6.00 min，90% A。

1.3.4.4 质谱条件

电喷雾离子源；接口电压4 000 V；正离子与负离同时扫描；多反应监测模式，吹扫气体为氮气，气体流量12 L/min；接口温度325 ℃；脱溶剂管温度325 ℃，加热模块温度400 ℃；碰撞气压力138 kPa，气体为高纯氮气。

1.4 数据处理

2 结果与分析

2.1 红树莓叶活性成分分析

表1 红树莓叶片水分含量Table 1 Moisture content of red raspberry leaves

图1 红树莓叶总酚、总黄酮、原花青素含量Fig. 1 Contents of total polyphenols, total flavonoids and proanthocyanidins in red raspberry leaf extracts

如表1、图1所示，6 种红树莓叶片提取物的总酚含量为3.48～5.56 mg/g；总黄酮含量为2.29～3.77 mg/g；原花青素含量为1.81～3.06 mg/g。欧洲红和红宝石的总酚含量较高，分别为（5.56±0.06）mg/g与（5.40±0.07）mg/g，二者之间在95%水平具有显著性差异；总酚含量最低的为秋福（3.48±0.09）mg/g。欧洲红的总黄酮含量最高，为（3.77±0.06）mg/g；总黄酮含量最低的为红宝石（2.29±0.05）mg/g。哈瑞泰兹的原花青素含量最高，为（3.06±0.04）mg/g，原花青素含量最低的为秋福（1.81±0.03）mg/g。

6 种不同红树莓叶片中活性成分含量最高的为总酚，这与旷慧等[20]在红树莓果渣中测得的实验结果相似。原花青素含量均为最低。但迟超[21]及宁玮钰[22]等的研究结果显示，果籽与果实中的原花青素含量相对较高，分析其原因可能是取样的部位不同，也可能是红树莓不同部位样品的采摘时期不同及成熟度不同。

2.2 红树莓叶提取物抗氧化能力分析

2.2.1 ABTS阳离子自由基清除能力分析

图2 红树莓叶提取物对ABTS阳离子自由基的清除能力Fig. 2 ABTS cation radical scavenging capacity of red raspberry leaf extracts

由图2可知，当样品质量浓度在12～50 mg/mL之间时，6 种不同品种的红树莓叶提取物清除ABTS阳离子自由基的能力随质量浓度增加而上升；在质量浓度大于50 mg/mL后，变化趋于平缓。在测定质量浓度范围内，6 种红树莓叶提取物清除ABTS阳离子自由基能力均大于VC。在质量浓度大于50 mg/mL时所有红树莓叶提取物ABTS阳离子自由基清除率均高于95%。

表2 红树莓叶提取物清除ABTS阳离子自由基的IC50值Table 2 IC50 values for ABTS cation radical scavenging capacity of red raspberry leaf extracts

由表2可知，所有品种的红树莓叶提取物清除ABTS阳离子自由基的IC50值均小于VC，即红树莓叶提取物的ABTS阳离子自由基清除能力大于VC。6 种红树莓叶提取物对ABTS阳离子自由基的清除能力由大到小依次为红宝石＞欧洲红＞澳洲红＞杜拉明＞哈瑞泰兹＞秋福。

2.2.2 DPPH自由基清除能力分析

如图3所示，当样品质量浓度在12～50 mg/mL之间时，红树莓叶提取物清除DPPH自由基的能力随质量浓度增加而上升，在质量浓度大于50 mg/mL后，变化趋于平缓。在质量浓度为12～30 mg/mL时，红宝石叶的提取物对DPPH自由基清除能力明显高于其他品种和VC处理组。当质量浓度高于50 mg/mL时，所有品种的叶提取物清除率均稳定在85%左右，略低于VC组。

表3 红树莓叶提取物清除DPPH自由基的IC50值Table 3 IC50 values for DPPH radical scavenging capacity of red raspberry leaf extracts

由表3可知，秋福、哈瑞泰兹与杜拉明的DPPH自由基清除能力IC50值略高于VC，其余3 种的IC50值小于VC，其中红宝石的IC50值为（18.16±0.11）mg/mL，明显低于VC组。6 种红树莓叶提取物对DPPH自由基的清除能力由大到小依次为红宝石＞欧洲红＞澳洲红＞杜拉明＞哈瑞泰兹＞秋福。

2.2.3 FRAP分析

图4 红树莓叶提取物FRAPFig. 4 FRAP of red raspberry leaf extracts

表4 红树莓叶提取物的FRAPTable 4 FRAP values for reducing capacity of red raspberry leaf extracts

如图4所示，红树莓叶提取物的FRAP与样品质量浓度呈良好的质效关系。在质量浓度为50～70 mg/mL时，秋福、红宝石、澳洲红的FRAP均高于VC对照组。其余3 种略低于VC组。当质量浓度为100 mg/mL时，除杜拉明外，其他品种红树莓叶提取物FRAP高于VC对照组。以不同浓度FeSO4（mmol/L）溶液为横坐标，734 nm波长处吸光度为纵坐标，得到曲线方程为y=0.560 3x＋0.157 9（R2=0.999 8），求得样品的FRAP值见表4。由表4可知，所有品种红树莓叶提取物的FRAP均高于VC，6 种红树莓叶提取物的FRAP大小依次为秋福＞红宝石＞澳洲红＞欧洲红＞哈瑞泰兹＞杜拉明。

2.3 红树莓叶提取物活性成分与抗氧化活性的相关性分析

表5 红树莓叶提取物活性成分与抗氧化活性的相关性分析Table 5 Correlation analysis between antioxidant activities and contents of active components in red raspberry leaf extracts

由表5可知，红树莓叶提取物的总酚与ABTS阳离子自由基清除能力（r=0.886，P＜0.05）和DPPH自由基清除能力（r=0.891，P＜0.05）有显著的正相关关系；ABTS阳离子自由基清除能力与DPPH自由基清除能力的相关性极显著，相关系数为0.992；即总酚对抗氧化活性的贡献最高，在检验红树莓叶抗氧化活性时可以选用ABTS阳离子自由基清除能力与DPPH自由基清除能力中的一种与其他检测方法共同评价红树莓叶片的抗氧化能力；这与Floegel等[23]的结论相似。本研究中总黄酮和原花青素与DPPH自由基清除能力和ABTS阳离子自由基清除能力均为正相关但不显著，但总黄酮与总酚的相关性较高（r=0.801），因为黄酮从属于多酚[24]，所以在抗氧化活性贡献上黄酮可以归入酚类物质行列，按照这种方法计算出总黄酮对DPPH自由基清除能力和ABTS阳离子自由基清除能力相关性为0.710和0.713，与Pearson分析结果相近（0.607、0.631）；说明在总酚的抗氧化活性贡献上总黄酮起到了较高程度的贡献作用，与刘世馨等[25]的实验结果一致。

DPPH自由基清除能力和ABTS阳离子自由基清除能力与FRAP相关性不高；这与Huang Haizhi等[26]的实验结果不同，其实验结果表明ABTS阳离子自由基清除能力、DPPH自由基清除能力与FRAP均有较高的相关性。分析原因是FRAP虽然与总黄酮与原花青素的相关性较好但与总酚的相关性不高，并且叶片中总酚的含量为最高，在抗氧化贡献上起主要作用，因此本实验中FRAP与其余2 种方法的相关性偏低。

2.4 红树莓叶提取物多酚的UPLC-MS/MS鉴定

由Pearson相关性分析可知，红树莓叶提取物清除ABTS阳离子自由基能力和清除DPPH自由基能力与其总酚呈现显著相关，为进一步明确红树莓叶提取物中的酚类物质的具体组成，利用UPLC-MS/MS法分析鉴定红树莓叶提取物中酚类物质，酚类物质的鉴定通过与标准品的总离子流色谱图的母离子峰、二级质谱的碎片和保留时间等质谱行为进行比较分析。采用外标法进行酚类物质的定量分析。如图5、表6～8所示。

图5 样品多酚总离子流色谱图Fig. 5 Total ion current chromatograms of polyphenols in different samples

表6 多酚类物质质谱检测参数Table 6 Tandem mass spectrometric parameters for polyphenols

表7 红树莓叶提取物中多酚含量Table 7 Polyphenol contents in red raspberry leaf extracts mg/100 g

表8 总量化多酚占总酚的百分比Table 8 Total quantified polyphenols as a percentage of total polyphenols

由表7、8可知，此方法测定出的13 种多酚总和占6 种红树莓叶中各自总酚的40.53%～86.07%，其中欧洲红、哈瑞泰兹、秋福均在75%以上，而其余3 种为40.53%～49.65%。6 种红树莓叶中除杜拉明外芦丁的含量最高，均超过了120 mg/100 g。丁香酸与木犀草素仅在哈瑞泰兹中鉴定出，分别为0.18 mg/100 g与0.08 mg/100 g。阿魏酸仅在杜拉明中鉴定出，为0.40 mg/100 g。检测出的13 种量化多酚在6 种树莓叶（根据含水量折算出干质量）中大小依次为欧洲红478.24 mg/100 g＞哈瑞泰兹316.00 mg/100 g＞秋福272.58 mg/100 g＞红宝石219.19 mg/100 g＞澳洲红210.01 mg/100 g＞杜拉明209.91 mg/100 g。

本方法共检测出6 种酚酸，其中鞣花酸为主要酚酸。Aleksandra等[27]的研究结果显示鞣花酸也为浆果类植物的主要酚酸，此外还含有大量的阿魏酸和绿原酸；但是本实验测定红树莓叶中的阿魏酸含量很低，原因可能是在果实和叶片中含量有差别，也可能是取样时果实和叶片的成熟度不同导致。6 种红树莓叶除红宝石外，对DPPH自由基与ABTS阳离子自由基清除能力强弱与其鞣花酸含量大小排列顺序一致，因为红宝石中鉴定出的酚类物质仅占其总酚的40%左右，起到显著抗氧化作用的物质也可能是其余未检出的酚类物质或是黄酮与原花青素类物质。

芦丁是植物中含量最丰富的化合物之一，在浆果果实中平均占总量化多酚的44.66%，在抗氧化活性贡献上起到重要作用[19,28-29]。本实验中测得芦丁含量约为总量化多酚的55%。在量化多酚占比高于70%的3 个品种（欧洲红、哈瑞泰兹、秋福）和量化多酚占比在40%～50%间的3 个品种（澳洲红、红宝石、杜拉明）中芦丁含量与清除ABTS阳离子自由基能力和清除DPPH自由基能力呈正相关。因本实验中存在未知酚类物质的作用（未检出），导致无法断定芦丁含量与抗氧化活性间的相关性是否显著，仍需继续深入的研究。

据报道，酚类物质在体外具有很强的抗氧化作用，存在于酚环中的双键，羟基侧链和糖基化都有助于清除自由基活性[30]。多酚类物质包括酚酸、类黄酮、芪类、单宁类等。而类黄酮物质包括黄酮醇（槲皮素、异鼠李素、金丝桃苷）、黄烷醇（儿茶素类）、黄酮（木犀草素、芦丁）等[24]。Fukumoto等[31]认为，在多酚分子结构中B环中的羟基增强了活性，相对于3和4碳位，在3、4和5碳位均含有萜类或羟基的多酚抗氧化活性更高。Seeram等[32]研究发现在C环中连接的糖苷上糖单位数与抗氧化活性呈负相关的关系。按照此方法推断本实验鉴定出的类似分子结构的7 种酚类物质（除酚酸）的抗氧化活性排列顺序为黄烷醇＞黄酮醇＞黄酮。但对本研究中量化多酚占总酚含量相近的树莓品种（40%左右的3 种：澳洲红、红宝石、杜拉明；70%左右的3 种：欧洲红、哈瑞泰兹、秋福）抗氧化活性强弱顺序比较发现，黄烷醇含量相对较高的红树莓叶与其抗氧化活性并不呈良好的量效关系，无法证实此结论。但袁博等[33]的实验中证实了黄酮醇（槲皮素）的抗氧化活性高于黄酮（芦丁），验证了此结论。分析其原因可能是红树莓中存在未知酚类物质的作用（未检出）或多种多酚的协同作用导致的整体抗氧化活性变化。

3 结 论

本实验比较了6 种不同品种红树莓叶中总酚、总黄酮、原花青素的含量及其与抗氧化活性的相关性；采用UPLC-MS/MS法对树莓叶中多酚类物质进行定性定量检测，该方法灵敏，高效。检出的13 种多酚以芦丁和鞣花酸为主，含有少量的儿茶素、表儿茶素、金丝桃苷、绿原酸、没食子酸，微量的槲皮苷、木犀草素、异鼠李素、阿魏酸、咖啡酸、丁香酸。相较于VC，6 种红树莓叶提取物抗氧化活性良好。红树莓叶中的其他酚类（酚酸类）物质尚需进一步鉴定。