传统发酵酸牛奶中产蛋白酶酵母菌的筛选及产酶条件优化

乔传丽， 金 丹， 蒋艾廷， 薛林林， 卢士玲， 李宝坤*

（石河子大学 食品学院，新疆 石河子 832000）

酵母菌在发酵过程中具有改善风味、增加产品功能、抑制有害菌的生长、益生保健等作用[1-2]；随着发酵技术的进步及基因工程的发展，酵母菌也被应用于传统发酵乳制品中。在我国利用微生物产蛋白酶研究还处于初始阶段；蛋白酶是水解蛋白质的一大类酶的通称，广泛自然界和微生物中，在食品、制药、造纸、洗涤添加剂等行业具有极高的应用价值，其用酶量占世界总用酶量的60%以上[3-4]。目前新的研究热点是从微生物中筛选新的活性物质[5-6]。芽孢杆菌属是主要产蛋白酶菌株[7-8]。产酶菌株种类的单一性不能满足工业化对各种酶类生产的需求[9]；另外，目前筛选的蛋白酶对于识别特定氨基酸序列的较少，从微生物中进行广泛从微生物中进行筛选是寻找特定蛋白酶的主要途径[10-13]。但目前关于乳酸菌应用报道很多，但是对于酵母菌作为附属发酵剂的报道却很少，特别对产蛋白酶的酵母菌研究。

新疆地理环境独特，少数民族采用传统的方法制备奶酪、酸奶等乳制品，这些传统发酵乳制品中，蕴藏着大量具有优良特性和益生作用的酵母菌。作者从新疆传统酸牛奶中筛选出高产蛋白酶酵母菌株，分别采用透明圈法和Folin-酚法对新疆传统酸牛奶中酵母菌高产蛋白酶菌株的分离和初步鉴定并对其酶学特性进行初步研究。

1 材料与方法

1.1 菌种来源、培养基与试剂

1.1.1 菌种来源 新疆塔城地区不同牧场采集的哈萨克族传统酸牛奶样品，样品经采集后装入无菌灭菌袋密封，封口后立即放入液氮罐中，实验室放置-80℃冰箱保存。

1.1.2 培养基 蛋白酶培养基：平板筛选培养基 葡萄糖 5 g/L，酪蛋白 10 g/L，蛋白胨 5 g/L，KH2PO41 g/L，NaCl 5 g/L，琼脂 20 g/L，pH 7.0。 发酵培养基 葡萄糖 50 g/L， 蛋白胨 10 g/L，KH2PO42 g/L，MgSO4·7H2O 0.4 g/L，pH 7.0。

1.1.3 试 剂 2×Taq PCR MAsterMix，TIANamp Yeast DNA kit（离心柱型）：天根生化科技有限公司产品；GelRed核染色剂：北京索莱宝科技有限公司产品；引物 NL-1（5'-GCATATCAATAAGCGGAGGA AAAG-3'），NL-4（5'-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3'）：上海生物工程有限公司产品。Folin-酚、酪氨酸、酪蛋白：均为国产分析纯试剂。

1.2 方法

1.2.1 产蛋白酶菌株的筛选 将分离、纯化得到的酵母菌株，接种在平板筛选培养基中，置于28℃恒温培养箱中培养2 d，测定其培养皿中菌株所产透明圈直径。培养皿中每3个透明圈的平均值记为该菌株的实验结果，计算 HE值（HE值=透明圈直径/菌落直径）。筛选出HE值较大的菌株进行复筛[14-15]。将初筛中HE值较大的菌株，接种于液体发酵培养基中，置于摇床 100 r/min，28℃培养2 d，5000 r/min离心取上清液，所得滤液即粗酶液，用于蛋白酶活力测定[16]。将初筛得到的株菌，在液体发酵培养基中进行增殖培养 （28℃2 d），离心取上清液。利用Folin-酚法[17-18]测定筛选出的酵母菌的蛋白酶活力。

1.3 产酶条件的优化

将筛选出来的菌株接种到液体发酵培养基中于，100 r/min条件下摇床培养。测定粗酶液中蛋白酶活，考察初始pH、培养温度和时间、接种量等发酵条件对菌株产酶活力的影响。

1.3.1 初始pH值对菌株产蛋白酶的影响 将培养基的初始 pH 值分别调节为 4、5、6、7、8、9，在 28 ℃、100 r/min条件下摇床培养2 d，在4℃、5000 r/min条件下10 min离心，取上清液测蛋白酶活力。

1.3.2 温度对蛋白酶活的影响 在温度分别为25、28、30、35、37、40、45、50 ℃下培养 2 d，在 4 ℃、5000 r/min条件下10 min离心，除去菌体，测定上清液粗蛋白酶活力，以确定最适反应温度，绘制酶催化温度曲线。

1.3.3 接种量对菌株产蛋白酶活力的影响 将初始菌液按体积分数1%、2%、3%、4%、5%接种量在最适温度和pH条件下将菌株在100 r/min条件下摇床培养，每隔12 h取样，离心取上清液测定酶活力，计算其他条件下的酶活力，绘制酶活曲线图。

1.4 菌株鉴定

1.4.1 菌株的形态及生理生化特性鉴定 菌株的形态和通过繁殖方式观察、碳源同化实验、氮源同化实验、糖发酵等生理生化特征进行鉴定。

1.4.2 26S rDNA基因的扩增和系统进化分析

1）酵母基因组总DNA的提取 依据酵母菌基因组DNA试剂盒（离心柱型）进行DNA提取。将提取得到的基因组DNA用灭菌的1.5 mL EP管收集，-20℃冰柜保藏备用。

2）酵母PCR扩增及扩增产物的检测 将提取的基因组DNA作为PCR扩增的模板，使用引物PCR扩增目的片段引物序列为NL-1和NL-4，引物扩增的目的片段大小在300～700 bp之间。PCR采用 50 μL 体系：2 x Master Mix 25 μ，NL1 和 NL4（10 μmol/L） 各 2 μL，DNA 模 板 2 μ，Nuclease-Free Water to 50 μL。PCR 反应条件：95℃预变性 7 min，36个循环 （94℃变性60 s，55℃退火60 s，72℃延伸 1 min），72 ℃延伸 8 min。

扩增反应完毕后，进行琼脂糖凝胶电泳，电压100 V，电泳液为1×TAE。电泳后，用EB染色20 min，紫外灯下观察，目的条带在300～700 bp范围内出现明亮的条带，-20℃冰箱保存备用。

2 结果与分析

2.1 产蛋白酶酵母菌的筛选结果

各培养基中HE值越大其产蛋白酶活力越强。产蛋白酶菌株的初筛结果如图1所示，初步得到5株在培养基上酶活力较大，分别是E1-5、D1-3、S1-16、S1-7、W1-10。根据酪蛋白标准曲线回归方程：Y=0.0104X+0.00022（R2=0.9998）得出菌株 D1-3的蛋白酶活力较高56.5 U/mL；其次为E1-5，蛋白酶活力为47.36 U/mL；最低的菌株是S1-7，其蛋白酶活力为14.56 U/mL，结果见图2。

图1 不同产酶菌株的透明圈与菌落直径比值Fig.1 Ratio of transparent circle diameter and the colony diameter

图2 不同菌株产酶能力Fig.2 Enzyme activity of strains

2.2 产酶条件的优化结果

2.2.1 培养基初始pH和培养温度对产酶活力的影响 培养基初始pH和培养温度对菌株产蛋白酶活力的影响如图3所示。研究得到初始pH偏高或偏低都不利于菌株产蛋白酶，本试验所得到的最适初始pH范围为5～6，在pH 5时产酶量最大。国内关于常温产蛋白酶的报道较少，陈明霞[19]从68株北极产蛋白酶菌株中筛选高产蛋白酶菌株11最适酶活温度为40℃，最适酶活pH约为 8.5。温度对菌种的产酶量较明显，除S1-17菌株在37℃产酶量较大，其余都在28℃时产酶量最大与赵有婷等[20]酵母菌最适产酶温度相适应。所筛菌株在低温和偏酸性条件下具有较好的蛋白酶生产能力。

图3 初始pH和培养温度对产酶的影响Fig.3 Effect of initial pH and temperature on the yield of protease

2.2.2 不同接种量对产酶的影响 将初始菌液按体积分数1%、2%、3%、4%、5%接种量在28℃条件下培养48 h，测定蛋白酶活力，不同接种量对蛋白酶活力的影响如图4所示。在接种量1%时酶活最低；随着接种量的增加酶活逐步上升在3%时酶活最大；接种量的增加，菌体生长旺盛导致培养基中营养物质快速消耗，因此蛋白酶活力逐渐下降。宋园亮等[21]元阳豆豉中高产蛋白酶乳酸菌的筛选及其产酶条件的研究中初始pH 5.0、接种量在3%、培养温度35℃培养36 h时达到了最佳产酶量32.50 U/mL。因此根据以上优化条件添加量在3%时达到了最高。

图4 不同接种量对产酶的影响Fig.4 Effect of different inoculation quantity on the yield of protease

2.2.3 培养时间对产酶的影响 在产蛋白酶最适初始pH和温度的条件下，培养时间对菌种产蛋白酶的影响如图5所示。菌株在12 h以内产蛋白酶活力较低；随着时间的增加，发酵液中菌株产蛋白酶活力也逐渐增加，48 h时蛋白酶活力达到了最高；随着时间的增产，由于营养物质的减少蛋白酶活力逐渐减少。因此筛选出的产蛋白酶酵母菌株的最适产酶时间在48 h时最佳。

图5 时间对菌株产酶的影响Fig.5 Effect of different time on the yield of protease

2.3 高产蛋白酶菌株鉴定

2.3.1 菌落形态及生理鉴定 根据《酵母菌的特征与鉴定手册》[21-23]和实验菌株的形态学和生理生化特性进行分析可得测试菌株中多为多端出芽的生殖方式，菌落形态差异明显；在碳源和氮源的同化上，各菌株均表现出不同的生理特性。在形态学分类的基础上，对以上酵母菌菌株进行初步的生理生化特性实验，E1-5能发酵葡萄糖、半乳糖，不进行乳糖、蔗糖和D-半乳糖发酵。S1-7和S1-16基本不能发酵糖类和硝酸盐类，根据以上的生理生化特性可初步鉴定W1-10号菌株为近平滑假丝酵母Candida parapsilosis；E1-5 为 东 方 伊 萨 酵 母Issatchenkia orientalis。根据以上生理生化特性其它酵母菌株并不能将其准确的鉴定出来。

表1 菌落形态特征Table1 Morphology of the strain

2.3.2 基于26S rDNA基因序列的酵母菌株系统发育分析 酵母菌的PCR扩增结果见图6。将所提取的酸奶样品的总DNA用26SrDNA的区引物进行PCR扩增，扩增产物经质量浓度1.0 g/dL琼脂糖电泳检测，获得约300～700 bp左右的特异性扩增条带，并且空白组无条带出现，说明未出现污染、无非特异性扩增现象。

图6 5株酵母菌PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图Fig.6 Agarose gel electrophoresis of PCR products from 5 yeast strains

依据酵母菌种类划分标准，同源性低于99%，不能划为同一个种[24]。根据生理生化鉴定和分子生物学鉴定结果，作者分离的酵母菌株与对应的标准菌株的同源性均在99%及以上，表明其具有较近的亲缘性。菌株S1-7为马克斯克鲁维酵母（Kluyveromyces marxianus）；菌株 S1-16 鉴定为单孢酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）；W1-10 鉴定为近平滑假丝酵母 （Candida parapsilosis）；D1-3鉴定为库德毕赤酵母（Pichia kudriavzevii）；E1-5 鉴定为东方伊萨酵母（Issatchenkia orientalis），结果如图7所示。26S rDNA基因序列的酵母菌株系统发育分析

图7 26S rDNA序列比对生成的5株酵母菌系统发育进化树Fig.7 Phylogenetic tree of 5 yeast strains based on 26S rDNA domain sequences

3 结语

从新疆哈萨克族传统发酵酸牛奶中分离筛产蛋白酶酵母菌菌株。以蛋白酶活性作为筛选指标进行初筛、复筛得到5株高产蛋白酶菌株并对其产酶条件进行优化。经形态观察及26S rDNA序列分析鉴定菌株 D1-3为Pichia kudriavzevii，E1-5为Issatchenkiaorientalis，S1-7为Kluyveromyces marxianus，W1-10 为Candida parapsilosis，S1-16 为Saccharomyces cerevisiae。将产酶条件优化得出：菌株 D1-3、S1-7、S1-16、E1-5 的最适产酶温度为 28℃，W1-10为37℃；菌株最适产酶初始pH、接种量和时间分别为5.0、3%、48 h。作者在筛选酵母菌高产蛋白酶的基础上同时也对蛋白酶的耐低温、高活性、耐酸等特点进行了初步研究。