十二井穴放血对脑梗死小鼠脑水肿及端粒生物合成的影响

涂 悦

脑梗死作为临床常见的一种脑血管病，其较高的致残率和致死率给病人及社会带来了沉重负担。而脑梗死后继发的脑水肿是致残和致死的重要原因之一，因此有效的控制脑水肿是治疗脑梗死的关键[1]。有研究表明，十二井穴放血疗法对改善脑梗死后脑水肿有一定疗效，但相关机制仍未阐明[2]。端粒是染色体末端的一段非编码重复序列，其随年龄增加及氧化应激、炎症等因素的累积而不断缩短，当缩短到一定程度时则会造成细胞凋亡，加重脑损伤[3]。这提示端粒可能是十二井穴放血疗法发挥脑保护作用的靶点之一。本实验通过构建脑缺血再灌注小鼠模型，以探讨十二井穴放血疗法对脑水肿的影响，同时进一步检测端粒长度和端粒生物合成的相关基因表达，从而为挖掘十二井穴放血疗法治疗脑梗死的机制提供更多的基础支持。

1 材料与方法

1.1 实验动物、试剂及仪器 C57BL雄性小鼠36只，30～35 g，购自天津医科大学动物实验中心。RNA/DNA共提取试剂盒(北京天根公司)，cDNA第一链合成试剂盒(北京天根公司)，实时荧光定量试剂盒(北京天根公司)，real-time PCR仪(StepOne Plus，美国ABI公司)，小动物麻醉机(深圳瑞沃德公司)。

1.2 方法

1.2.1 动物分组及模型的构建 将小鼠随机分为3组，即对照组、大脑中动脉栓塞组(MCAO组)和井穴放血组，每组12只。MCAO组和井穴放血组采用线栓法构建大脑中动脉栓塞模型：以400 mL/min的3%异氟烷诱导麻醉，随后改为2%浓度持续麻醉。取颈正中切口，分离并暴露右侧颈内、外动脉分叉处。结扎颈外动脉并在颈内动脉上打一活结暂不结扎，为稍后固定线栓做准备。于颈内、外动脉分叉处远端结扎以阻断血流，在分叉处近端夹一动脉夹，而后在颈总动脉结扎线和动脉夹之间剪一切口，将线栓从切口插入至动脉夹处，此时将颈总动脉连同线栓一同结扎，松紧以不影响线栓的移动为宜，撤去动脉夹，将线栓继续向颈内动脉插入1 cm左右，此时结扎颈内动脉上的套线以固定线栓，缝合皮肤，并在体外留有线栓的另一头。1 h后缓慢拨出部分线栓，剪断体外部分。

1.2.2 十二井穴放血 参考相应的人体穴位解剖标志，用1 mL注射器针刺小鼠双前肢趾尖端的十二井穴，出血量约为每穴10 μL，每日2次，共6次。

1.2.3 改良神经功能损伤评分(mNSS)及标本采集 3组小鼠均于术后72 h行mNSS评分[4]，0分为正常，18分为最严重，分数越高说明症状越严重。评分后立即处死小鼠，各组均取缺血半暗带同一位点约10 mg脑皮质，进行DNA/RNA的提取，剩余脑组织进行含水量测量。

1.2.4 相关基因表达及端粒拷贝数测定 提取脑组织基因组DNA和总RNA，并将RNA反转录成cDNA，检测端粒酶逆转录酶(telomerase reverse transcriptase，TERT)，端粒重复序列结合因子1/2(telomeric repeatbinding factor 1/2，TRF1/2)以及端粒长度。方法如下：配制25 μL PCR反应体系，其中样本量为cDNA 10 ng或基因组DNA 50 ng，每个基因均设置3个复孔。反应条件为两步法：95 ℃ 10 min预变性，随后95 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min，共40个循环。应用2-ΔΔCt法计算各目的基因的相对表达量，各基因引物序列如下，TERT上游：AGTGGTGAACTTCCCTGTGG，下游：CAACCGCAAGACTGACAAGA；TRF1上游：TACCAAACTCAAGCCCCATC，下游GCAGCAAACTCACATCGAAA；TRF2上游TGAAGTTCGCATTTTGATGGC，下游：CTTTGGTCCTGGCATCTCTAC；端粒上游：GGTTTTTGAGGGTGAGGGTGAGGGTGAGGGTGAGGGT，下游：TCCCGACTATCCCTATCCCTATCCCTATCCCTATCCCTA；GAPDH上游：TACACTGAGGACCAGGTTG，下游：CCCTGTTGCTGTAGCCATA；36B4上游：TGTGTTAGGGGACTGGTGGACA，下游：CATCACCCACTTACCCCCAAAA。

1.2.5 脑组织含水量测定 取脑后去除小脑及脑干，立即称重所得质量为湿重。随后将其放至烘箱中75 ℃烘烤48 h，称重，所得为干重。含水量=(湿重-干重)/湿重。

1.3 统计学处理 应用SPSS 17.0软件，3组比较采用单因素方差分析，进行两两比较采用LSD法。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 神经功能损伤 脑缺血再灌注后小鼠mNSS评分均显著升高，应用井穴放血后，井穴放血组mNSS显著低于MCAO组(P<0.05)。详见表1。

2.2 各基因表达及端粒长度变化 与对照组比较，MCAO组和井穴放血组小鼠端粒长度显著降低，TERT、TRF1和TRF2基因表达水平显著升高(均P<0.05)；与MCAO组比较，井穴放血组小鼠端粒长度增加，TRET、TRF1和TRF2基因表达水平显著升高(均P<0.05)。详见表1。

2.3 脑组织含水量 MCAO组和井穴放血组小鼠脑组织含水量与对照组比较均显著增高，井穴放血组显著低于MCAO组(均P<0.05)。详见表1。

组别只数mNSS评分(分) TERT TRF1 TRF2 端粒长度脑组织含水量MCAO组127.35±2.641) 1.74±0.401)3.33±0.891)3.02±0.651)0.51±0.161)0.792±0.0061)井穴放血组124.75±1.451)2)2.84±0.561)2)4.70±0.951)2)4.69±0.951)2)0.75±0.111)2)0.779±0.0081)2)对照组120 1.14±0.27 0.99±0.391.10±0.171.09±0.200.760±0.007

与对照组比较，1)P<0.05；与MCAO组比较，2)P<0.05

3 讨 论

井穴位于四肢的末端，是十二经脉气血的起始之处，针刺该处可促进气血运行，有起死回生救急之妙用[2]。脑水肿是脑梗死后常见并发症，一般于发病后2～4 d达到高峰，主要由细胞缺血缺氧造成的氧化应激、炎症反应所引起，导致颅内压急剧升高，使病情加重，甚至造成脑疝，威胁生命[5]。本实验中，当应用井穴放血疗法后，可有效减轻脑梗死小鼠的神经功能损伤症状，同时也减轻了脑梗死后的脑水肿，表明在脑梗死时应用井穴放血疗法可发挥一定的脑保护作用。这与阮建国等[6]得出的结论一致，其发现在常规西药的基础上，加用十二井穴放血疗法可有效改善脑梗死病人的日常生活能力及神经功能；滕安琪等[7]也发现十二井穴刺络放血对急性脑梗死病人早期运动功能和日常生活活动能力恢复有明显的促进作用，但上述研究并未深入探讨其潜在机制。端粒是细胞内调控凋亡启动的重要基因序列，当端粒长度缩短至一定程度时，可通过抑制线粒体氧化呼吸链相关蛋白的基因转录与表达，造成线粒体功能障碍，进而通过端粒-线粒体途径引起脑水肿，造成细胞凋亡[8]。为此实验中进一步检测了缺血半暗带脑组织中端粒生物合成相关基因的表达及端粒长度的变化，以探索十二井穴放血疗法发挥脑梗死后脑保护作用的潜在靶点。

本实验发现，脑梗死后脑组织中端粒长度明显缩短，且脑水肿明显，表明脑缺血可通过导致端粒损伤而加重脑水肿。当机体因脑缺血而进入应激状态时，活性氧族及炎症因子的增加可直接损伤端粒，受损的端粒通过诱导P53基因的表达，激活线粒体凋亡信号通路，促使细胞毒性脑水肿的发生[9]。同时这些因子还可抑制端粒酶及端粒结合蛋白TRF1、TRF2的活性，削弱端粒修复系统的功能，促进端粒加速缩短[10]。本实验结果可见脑梗死小鼠脑组织中TERT、TRF1和TRF2基因表达升高，这可能是端粒修复系统受到抑制时，端粒生物合成相关基因发生代偿性升高的结果。应用井穴放血后，脑梗死小鼠TERT、TRF1和TRF2基因表达进一步升高，且端粒长度明显延长，表明十二井穴放血疗法可能是通过激活端粒生物合成相关基因的表达，促进端粒的修复，从而减少细胞凋亡及线粒体功能障碍，增加细胞能量供应的同时减轻脑水肿严重程度，发挥神经保护作用。

本实验通过建立脑梗死小鼠模型，探讨了井穴放血疗法对脑水肿及端粒生物合成相关基因表达的影响，为探索十二井穴放血发挥神经保护作用的机制提供了基础研究，或许可为脑梗死的临床治疗以及井穴放血疗法的临床应用提供一定的帮助。