骨化三醇对肺炎支原体肺炎患儿Th17/Treg失衡的干预作用

曹 正 余 蓉 薛 冰 王建荣

肺炎支原体肺炎(mycoplasma pneumonia pneumonia，MPP)是由肺炎支原体(mycoplasma pneumonia，MP)引起的肺实质和(或)间质的急性感染，约占儿童社区获得性肺炎的10%～30%[1]。世界范围内流行病学研究表明，每隔3～7年MP感染会出现周期性社区流行，持续数月到数年不等[2]。部分患儿病情较重，常累及全身多个系统，严重影响儿童的身心健康。骨化三醇[1，25(OH)2D3]作为体内维生素D的重要产物，近年来，应用不仅局限于调节钙磷代谢及内分泌功能，其抗炎、抗感染、免疫调节作用得到广泛关注[3]。刘金等[4]研究表明，MPP患儿存在维生素D缺乏。杜许芳等[5]研究表明，Th17/Treg失衡参与了MPP的发病过程。邵美琪等[6]报道予以维生素D体外培养哮喘患者外周血单个核细胞，可使Treg 细胞水平升高，Th17 细胞降低。但MPP患儿能否口服维生素D调节Th17/Treg失衡，目前少见相关报道。本实验拟定以维生素D辅助治疗MPP，旨在探索维生素D对Th17/Treg失衡的调节作用及可能存在的机制，为MPP患儿合理补充维生素D改善免疫失衡及临床症状提供理论依据。

对象与方法

1.研究对象：选取2018年9～12月在新疆医科大学第五附属医院儿科病房收治的50例MPP患儿为实验组，并选取50例健康儿童为对照组，两组患儿在年龄、性别、BMI方面比较，差异无统计学意义(P>0.05)。实验组纳入标准：50例患儿均符合MPP的诊断标准[7]：病程3～7天，伴咳嗽、发热；肺部听诊可闻及固定湿性啰音，胸部X线检查显示点片状阴影；血清特异性MP-IgM≥1∶160为阳性。排除标准：①合并肺部其他疾病及多种病原体感染；②合并先天性疾病、免疫缺陷病、营养不良、甲状腺、肝脏、肾脏疾病及佝偻病；③入院前或病程中需要应用激素及免疫调节剂。实验组随机分为维生素D干预组、非维生素D干预组各25例，两组患儿一般情况及病情严重程度比较，差异无统计学意义，均给予常规治疗(止咳祛痰药物静脉滴注+阿奇霉素口服，所用药物频次及厂家相同)，干预组在常规治疗基础上同时口服维生素D制剂(400 IU/次，1次/天，厦门星鲨)治疗2周。本研究经医院伦理学委员会同意，所有参与者受试前均签署知情同意书。

2.研究方法：纳入标准的患儿均于入院第2天及2周后采集清晨空腹血6ml，肝素抗凝，取3～4ml全血加入PBS对倍稀释，缓慢倒入装有4ml淋巴细胞分离液的离心管中，离心后取白膜层，3倍体积的PBS将其洗3遍，1640培养基重悬，调整细胞浓度2×106/ml，收集100μl细胞至离心管中，严格按说明书步骤依次加入胞内染色冲洗缓冲液(intracellular staining perm wash buffer)、固定缓冲液(fixation buffer)洗涤重悬细胞，加入20μl Th17/Treg细胞抗体，避光孵育0.5h，洗涤后重悬细胞，加入细胞染色缓冲液(cell staining buffer)0.5ml，分别以CD3+/CD4+/IL-17+、CD4+/CD25+/Foxp3设门，上机检测。分析Th17、Treg细胞的百分率。其余静脉血静置2～4h后以3000r/min速率离心15min,分离血清，ELISA法检测血清中1,25(OH)2D3、IL-17及IL-10水平(美国BD公司)，严格按照操作说明进行。

结 果

实验组患儿1,25(OH)2D3、Treg及IL-10细胞水平均低于对照组儿童，Th17及IL-17高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，详见表1。

表1 实验组及对照组患儿1，25(OH)2D3、IL-10、IL-17含量及Treg、Th17水平比较

治疗前两组患儿1,25(OH)2D3、Treg、IL-10、Th17及IL-17水平比较，差异无统计学意义(P均>0.05)，具有可比性。干预组治疗后1,25(OH)2D3、Treg及IL-10水平较治疗前增加(P<0.05)，Th17及IL-17水平较治疗前降低(P<0.05)；非干预组治疗后1,25(OH)2D3、Treg及IL-10水平较前增加，Th17及IL-17含量降低，但治疗前后比较，差异无统计学意义(P>0.05)，详见表2。

表2 两组治疗前后1，25(OH)2D3、IL-10、IL-17含量及Treg、Th17水平比较

干预组与非干预组治疗效果比较，干预组患儿咳嗽消失时间及喘息消失时间均低于非干预组，差异有统计学意义(P<0.05)。干预组患儿肺部啰音消失时间、体温正常时间及平均住院时间与非干预组比较，差异无统计学意义(P>0.05)，详见表3。

表3 两组患儿治疗效果比较天)

讨 论

MPP是儿童常见的呼吸道感染性疾病，其发病机制尚不十分明确，研究多倾向于病原对气道上皮直接破坏和免疫功能引起的损伤，其中免疫紊乱被认为是推动MPP病情进展的关键因素[2]。Treg及Th17细胞均由转化生长因子-β (transforming growth factor-β，TGF-β) 诱导初始T细胞分化而成，在功能上相互抑制，且在一定情况下可以互相转化，共同维持免疫状态的稳定[8]。Treg细胞对免疫细胞具有负性调节作用，通过分泌IL-10、IL-4等效应细胞因子抑制T细胞的活化和增殖，间接发挥免疫抑制功能[9]；Th17则以分泌效应性细胞因子IL-17为特征，诱导中性粒细胞和单核细胞聚集，刺激并释放大量炎性因子及趋化因子，如IL-8、TNF-α和 IL-1β等，促进和放大炎性反应[10]。

本研究表明，MPP患儿急性期存在Th17/Treg细胞失衡，促炎性细胞Th17升高，抑制炎性细胞Treg降低，与朱章华等[11]研究结果相一致，其机制可能为MP感染后通过黏附蛋白吸附于上皮细胞表面受体，激活并诱导抗原递呈细胞分泌炎性细胞因子如IL-1β和IL-6等，导致Treg细胞凋亡并向Th17细胞转化，产生IL-17以发挥其促炎作用，最终Th17/Treg免疫平衡失调，推动了MPP患儿疾病的进展[12]。

维生素D在肺的微环境中发挥重要的免疫调节作用，目前测定血清1，25(OH)2D3评估体内维生素 D 的含量是最准确的方法[13]。本研究纳入50 例MPP患儿，检测出血清中1，25(OH)2D3水平低于对照组，差异有统计学意义，与缪美华等[14]研究结果相一致，考虑体内1，25(OH)2D3缺乏可能是导致儿童MPP发生的潜在病因，其水平降低能引起呼吸道黏膜上皮变性、角化和增生，致使气道上皮合成并分泌抗菌肽、防御素、单核-吞噬细胞等减少；同时引起B淋巴细胞分化和成熟障碍，免疫球蛋白水平降低，多种因素共同作用下患儿免疫功能出现紊乱，增加了MPP患儿的发病风险[15，16]。

1，25(OH)2D3作为体内最基本的信号分子，通过内分泌的方式联系细胞外刺激和细胞内基因应答[17]。气道上皮细胞、单核细胞及树突状细胞中均存在维生素D受体(vitamin D receptor，VDR)的表达，肺部受到感染时，局部组织1，25(OH)2D3合成增加，通过维生素D结合蛋白(vitamin D binding protein,VDBP)运送至细胞核内的VDR，激活并表达一系列抗菌因子调节肺组织局部免疫[18]。Gregori等[19]动物实验表明维生素 D 可诱导小鼠体内Treg细胞的生成，王茜等[20]报道维生素D可通过抑制Rhoa/Rock信号通路，减少Th17及IL-17的产生。本研究发现，常规治疗基础上给予MPP患儿口服维生素D可提高体内1,25(OH)2D3浓度，有效降低Th17 细胞水平，提高 Treg细胞比例，部分纠正 Th17/Treg 细胞失衡。分析其机制为在幼稚T细胞发育的过程中，1，25(OH)2D3一方面可阻止幼稚树突状细胞向成熟树突状细胞分化，促进Treg生成并分泌IL-10因子，还可通过IL-17启动子招募组蛋白去乙酰化酶 (histone deacetylase,HDAC)，抑制IL-17启动子募集Runt相关转录因子1 (Runx1)来下调IL-17的水平，进而阻抑CD4+T细胞向Th17亚群分化[21，22]。本实验研究过程中共有3例患儿出现肺不张、胸腔积液等肺内外并发症，多次调整抗生素并予以地塞米松静脉滴注，因糖皮质激素具有抑制细胞及体液免疫、抗炎、退热等功效，为实验混杂因素，故未纳入实验结果。

研究显示，IL-17可促进α-平滑肌肌动蛋白和 Rhoa蛋白的表达，导致小气道广泛的收缩痉挛，加重气道反应性[23]。本实验干预组患儿给予维生素D后咳嗽及喘憋症状消失时间较非干预组缩短，考虑维生素D可通过下调IL-17减轻气道炎性反应，进而改善呼吸道症状；干预组患儿体温恢复正常时间及总住院时间较非干预组缩短，但差异无统计学意义，可能与样本量较少有关，两组患儿肺部啰音吸收时间比较差异无统计学意义。IL-17为具有双向作用的因子，急性感染期机体需要强有力的免疫应答清除病原，此时IL-17在炎性反应部位聚集并发挥其抗感染作用，据此可推测早期感染越重，炎性反应越强烈，IL-17水平越高，在疾病恢复期高水平的IL-17可致炎性损伤不利于疾病转归，有研究证实MPP患儿严重程度与血清IL-17水平呈正相关[24]。若MPP患儿病情发展至重症肺炎支原体肺炎(severe MPP,SMPP)，则治疗难度较大，能否通过口服维生素D降低IL-17以减少SMPP发病的风险，为今后研究方向。

综上所述，维生素D辅助治疗MPP可在一定程度上调节Th17/Treg失衡并改善呼吸道症状。由于本研究样本量较小、观察周期较短，需扩大样本量明确其临床疗效，并规范维生素D的用法、用量，随着研究的不断深入，将为MPP的干预和治疗提供新的靶点。