MS-222和丁香酚对暗纹东方鲀幼鱼麻醉效果的比较研究

郝长杰，庄 平，3，赵 峰，3，张 涛，3，黄晓荣，方可菲，蒋 俊

（1.水产科学国家级实验教学示范中心，上海海洋大学，上海 201306；2.中国水产科学研究院东海水产研究所，上海 200090；3.农业农村部东海与长江口渔业资源环境科学观测实验站，上海 200090）

暗纹东方鲀（Takifugu obscurus），俗称河豚，隶 属 鲀 形 目 （Tetraodontiformes），鲀 科（Tetraodontidae），东方鲀属，属江海洄游性鱼类，主要分布于我国的黄海、渤海、东海和长江中下游及其通江湖泊［1］。暗纹东方鲀具有个体大、生长速度快、肉质鲜嫩、营养价值高等优点，曾是长江口及下游江段重要的渔业捕捞对象之一，目前已经成为我国主要的养殖河鲀种类［2-3］。由于过度捕捞、环境污染等诸多因素，导致暗纹东方鲀天然资源严重衰退，20世纪80年代后已不能形成渔汛。增殖放流是恢复天然资源、维持生态平衡的重要手段之一［4-5］，但放流过程中标志、运输等环节会对鱼体造成刺激和损伤，麻醉是减少鱼体应激反应、提高放流成活率的重要技术手段。

麻醉剂因能够起到一定的镇定麻痹作用，被广泛应用到水产动物的生产、运输等领域［6］。目前，可用于水产动物的麻醉剂种类繁多，有丁香酚、MS-222、苯唑卡因、2-苯氧乙醇等近30余种，其中在养殖和生产上使用最多的是MS-222和丁香酚［7-8］。MS-222是水产动物中普遍认为非常安全、有效的一种麻醉剂，在全世界范围内得到广泛应用；丁香酚提取自丁香树的茎叶和花朵，其优点是廉价易得，但具有较强的挥发性，药效会随着时间的延长逐渐减弱［9-10］。目前，国内外尚未见暗纹东方鲀麻醉研究的相关报道。本实验通过研究MS-222和丁香酚两种麻醉剂在不同浓度、不同水温及麻醉后在空气中不同的暴露时间对暗纹东方鲀幼鱼麻醉效果的影响，以期为暗纹东方鲀的养殖生产、增殖放流等研究提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

本实验于2018年11月在中国水产科学研究院东海水产研究所实验室进行，实验幼鱼平均全长（14.01±0.21）cm，平均体质量（71.37±3.24）g，于12 m3循环水养池中暂养1月。实验用水为盐卤和曝气自来水配制而成，水温（15.90±0.10）℃，盐度 8.50±0.10，pH 7.80±0.10，保持溶氧7.50 mg·L-1以上，实验开始前停食24 h。

1.2 实验药品

MS-222（北京格林恒兴生物科技有限公司），水溶液呈弱酸性，为减少麻醉时产生的应激反应，使用时与碳酸氢钠按质量比1∶1混合溶于水。

丁香酚（国药集团化学试剂有限公司），几乎不溶于水，为提高溶解效率，使用时按质量比1∶5溶于酒精后再溶于水。

1.3 暗纹东方鲀幼鱼麻醉及复苏过程分期及预实验设置

实验开始前，先进行预实验。水温（15.90±0.10）℃条件下，MS-222和丁香酚各设置10、20、30、40、50、60、70、80 mg·L-18个质量浓度梯度组，每组10尾鱼，各设2个平行，记录鱼的麻醉、复苏时间并观察最终麻醉状态及复苏情况。根据刘长琳等［7］的研究，同时结合暗纹东方鲀幼鱼自身的行为特征对整个过程进行分期。

暴露时间梯度先进行预实验，在水温（15.90±0.10）℃条件下设 5、10、15、20、25 min 5个时间梯度。每组10尾鱼，各设2个平行，观察复苏过程中的行为表现，记录复苏时间及成活率。基于以上预实验结果开展以下实验内容。

1.4 MS-222和丁香酚对暗纹东方鲀幼鱼麻醉及复苏时间的确定

参考MARKING等［11］的研究结果，有效质量浓度的标准为：实验用鱼在3 min内麻醉、5 min内复苏，且麻醉时间长达15 min后成活率为100%。根据预实验结果，设置MS-222浓度梯度为 100、110、120、130、140、150、160、170 mg·L-18个梯度组，丁香酚浓度梯度为50、60、70、80、90、100、110、120 mg·L-18个梯度组。实验开始前，先将鱼放到实验桶中适应到稳定阶段，再加入麻醉剂，每组放10尾鱼，各设3个平行，实验时仔细观察每条鱼的活动状态及行为特征，到达麻醉6期时，及时捞出，放入洁净的海水中复苏。记录每尾鱼到达麻醉6期和复苏4期时所需的时间及成活率。其中，麻醉时间是指麻醉剂放入实验桶中后实验鱼到麻醉6期所用的时间；复苏时间指鱼放入洁净海水中后到复苏4期时所需要的时间。

1.5 MS-222和丁香酚在不同水温下对暗纹东方鲀幼鱼的麻醉效果

根据1.3和1.4实验结果，MS-222和丁香酚有效质量浓度分别为120～140 mg·L-1和60～70 mg·L-1。选择130 mg·L-1的 MS-222和60 mg·L-1的丁香酚进行不同水温对暗纹东方鲀幼鱼麻醉及复苏的影响实验。设置温度梯度为：16、18、20、22、24℃，温度用加热棒调控，用数显温度计实时记录水温，保持温度误差≤0.10℃。每组10尾鱼，各设3个平行，实验前先将鱼放入实验桶中，缓慢提升水温适应到稳定阶段后分别放入对应浓度的麻醉剂，记录每尾鱼麻醉和复苏所需时间。

1.6 深度麻醉后空气中不同暴露时间对暗纹东方鲀幼鱼复苏及成活率的影响

根据 1.3和 1.4实验结果，选择 130 mg·L-1的MS-222和60 mg·L-1的丁香酚进行空气中不同暴露时间对暗纹东方鲀幼鱼复苏时间及成活率的影响实验。设置MS-222暴露时间梯度为：5、10、15、20、25、30 min，丁香酚暴露时间梯度为：2、4、6、8、10、12、15、20 min，并设对照组（未暴露），每组10尾鱼，各设3个平行，实验水温（15.90±0.10）℃。整个过程在湿润洁净的毛巾上进行，仅头部露于空气中，记录复苏时间及成活率。

1.7 数据处理

所得数据的分析和处理均采用Microsoft Excel和SPSS24.0统计软件，并用单因素方差分析和Duncan法进行显著性分析和多重比较，描述性统计结果以平均值±标准差（Mean±SD）表示，显著性水平设为0.05。

2 结果与分析

2.1 暗纹东方鲀幼鱼麻醉及复苏过程行为特征的观察及分期

暗纹东方鲀幼鱼在MS-222和丁香酚两种麻醉剂的作用下，在麻醉阶段和复苏阶段具有明显不同的行为特征。据此，可以区分不同的麻醉阶段（表1）和复苏阶段（表2）。

由表3可知，当MS-222在10～50 mg·L-1、丁香酚在10～20 mg·L-1时，幼鱼的最终麻醉状态始终保持在镇定或轻度麻醉期，随着麻醉剂浓度增加，麻醉程度加深，分别在60 mg·L-1和30 mg·L-1时进入麻醉6期（延髓麻醉期）。

2.2 MS-222和丁香酚对暗纹东方鲀幼鱼麻醉、复苏时间及有效质量浓度的确定

MS-222对暗纹东方鲀幼鱼的麻醉效果如图1所示：随着MS-222质量浓度的上升，幼鱼的麻醉时间逐渐缩短，复苏时间逐渐延长。单因素方差分析可知：MS-222浓度为160 mg·L-1时，麻醉时间为（95.20±6.14）s，与 170 mg·L-1无显著性差异（P＞0.05），复苏时间各组均存在极显著差异（P＜0.01）。MS-222的质量浓度大于120 mg·L-1时，幼鱼的平均麻醉时间小于3 min；MS-222的质量浓度小于140 mg·L-1时，幼鱼的平均复苏时间小于5 min，且麻醉15 min后成活率为100%。根据MARKING等［11］有效质量浓度的标准，得出MS-222对暗纹东方鲀幼鱼的有效质量浓度为120～140 mg·L-1。

从图2可以看出，丁香酚对暗纹东方鲀幼鱼的麻醉效果随着质量浓度的增加，麻醉时间逐渐缩短，复苏时间逐渐延长。单因素方差分析可知：50 mg·L-1时，幼鱼的麻醉时间为（192.00±15.23）s，显著高于其他组（P＜0.05），复苏时间为（218.00±11.20）s，显著低于其他组（P＜0.05）。120 mg·L-1时麻醉时间缩短到（75.40±3.50）s，与 110 mg·L-1无显著性差异（P＞0.05），复苏时间延长到（494.60±11.93）s，极显著高于其他组（P＜0.01）。同上麻醉时间小于3 min、复苏时间小于5 min条件得出丁香酚对暗纹东方鲀幼鱼的有效质量浓度为60～70 mg·L-1。

表1 暗纹东方鲀幼鱼麻醉过程的主要行为特征及分期Tab．1 Stages and main behavior characteristics of T．obscurus juveniles during anesthesia process

表2 暗纹东方鲀幼鱼复苏过程的主要行为特征及分期Tab．2 Stages and main behavior characteristics of T．obscurus juveniles during recovery process

表3 不同浓度MS-222和丁香酚对暗纹东方鲀幼鱼的麻醉效果及程度分期Tab．3 Anesthetic effects and degree stages of different concentrations of MS-222 and clove oil on T．obscurus juveniles

图1 不同浓度MS-222对暗纹东方鲀幼鱼麻醉时间和复苏时间的影响Fig．1 Effect of different MS-222 concentrations on anesthsesia time，recovery time in T．obscurus juveniles

图2 不同浓度丁香酚对暗纹东方鲀幼鱼麻醉时间和复苏时间的影响Fig．2 Effect of different clove oil concentrations on anesthsesia time，recovery time in T．obscurus juveniles

2.3 两种麻醉剂在不同水温环境下对暗纹东方鲀幼鱼麻醉效果的影响

从图3可以看出，MS-222（130 mg·L-1）组随着水温的升高，麻醉时间和复苏时间均逐渐缩短。单因素方差分析可知：麻醉时间温度18℃组与16℃组无显著性差异（P＞0.05），20℃组与22℃组无显著性差异（P＞0.05），24℃组麻醉时间最短仅为（105.20±3.50）s，极显著低于其他组（P＜0.01）；复苏时间各组间均存在极显著性差异（P＜0.01）。

图3 不同水温下MS-222对暗纹东方鲀幼鱼麻醉效果的影响Fig．3 Anesthesia effect of MS-222 on T．obscurus juveniles in different temperatures

图4表明，丁香酚（60 mg·L-1）组随着水温的升高，幼鱼的麻醉和复苏时间均逐渐缩短。麻醉时间各组间均存在显著性差异（P＜0.05）；复苏时间各组间均存在极显著性差异（P＜0.01），24℃组复苏时间已经缩短到（157.00±6.99）s。

2.4 空气中暴露时间对暗纹东方鲀幼鱼复苏效果的影响

由图5可知，经130 mg·L-1MS-222深度麻醉的幼鱼，随着在空气中暴露时间的延长，复苏时间先缩短后延长。单因素方差分析表明，复苏时间各组间均存在显著性差异（P＜0.05），幼鱼在暴露20 min时复苏时间为（204.58±6.23）s，与25 min组存在极显著差异（P＜0.01），且自20 min后，复苏时间的延长趋势明显加快。

图4 不同水温下丁香酚对暗纹东方鲀幼鱼麻醉效果的影响Fig．4 Anesthesia effect of clove oil on T．obscurus juveniles in different temperatures

图5 空气中暴露时间对MS-222深度麻醉暗纹东方鲀幼鱼复苏时间的影响Fig．5 Effect of air exposure time on recovery time in MS-222 deep anesthesia T．obscurus juveniles

由图6可知，经60 mg·L-1丁香酚深度麻醉的幼鱼，随着暴露时间的延长，复苏时间逐渐延长。单因素方差分析表明，暴露4 min与6 min复苏时间无显著性差异（P＞0.05），其余各组间均存在显著性差异（P＜0.05）。暴露6 min后，幼鱼的复苏时间明显延长，暴露15 min时幼鱼的成活率为100%，但此时的复苏时间已超过500 s，暴露20 min时幼鱼成活率下降到80%。

图6 空气中暴露时间对丁香酚深度麻醉暗纹东方鲀幼鱼复苏时间的影响Fig．6 Effect of air exposure time on recovery time in clove oil deep anesthesia T．obscurus juveniles

3 讨论

3.1 麻醉剂的作用机制与有效质量浓度的确定

麻醉剂的主要作用是抑制脑皮质的中枢神经系统，对机体产生一定的麻痹作用，从而在面对外界的刺激时，降低应激，达到一定的保护作用［12］。一般的麻醉剂首先会抑制脑的皮质（触觉丧失期），再作用于基底神经节与小脑（兴奋期），最后作用于脊髓（麻醉期）［13-14］。它能够在一定的时间内使鱼体维持在一个休眠状态，低消耗，低应激，新陈代谢缓慢，同时对氧气的需求降低，二氧化碳及氨的排放也降低［15］。MS-222和丁香酚麻醉溶液首先通过鱼的体表及鳃丝的呼吸作用进入到鱼体内的血液循环系统，之后再经过血液的运输作用传导至脑部的中枢神经系统，能够｀在很短的时间内使鱼的活动能力及反射能力受到抑制，且麻醉剂进入鱼体内后不能被完全降解，主要聚集于肝脏和脾脏中，肌肉中含量很低［16-17］。

从实验结果可以看出：随着麻醉剂浓度的逐渐增加，暗纹东方鲀幼鱼的麻醉时间逐渐缩短，复苏时间逐渐延长；MS-222和丁香酚浓度分别为60 mg·L-1和30 mg·L-1时，幼鱼的最终麻醉程度能达到麻醉6期。即麻醉剂浓度越高，幼鱼越容易麻醉而越不容易复苏。这与彭宁东等［18］研究赤眼鳟（Spualiobarbus curriculus）幼鱼和王秀华等［19］研究牙鲆（Paralichthys olivaceus）的研究结果一致。

MS-222和丁香酚对暗纹东方鲀幼鱼的有效质量浓度分别为120～140 mg·L-1与60～70 mg·L-1，与 胡 发 文 等［20］研 究 大 泷 六 线 鱼（Hexagrammos otakii）幼鱼的研究结果不同，MS-222和丁香酚对大泷六线鱼幼鱼的有效麻醉质量浓度分别为 50～70 mg·L-1与 50～100 mg·L-1。这可能与两种鱼的生活习性、规格大小等有关，具体原因还需进一步研究。不同种类的麻醉剂及相同种类不同浓度的麻醉剂对不同的鱼麻醉效果不同，因此，须根据鱼体的大小、种类、健康生理状况，以及生活的水温、水质等来选择最合适的麻醉剂。

3.2 水温对深度麻醉暗纹东方鲀幼鱼麻醉及复苏时间的影响

水温是影响麻醉效果的一个重要环境因子［21］。鱼类为变温动物，在适宜温度范围内，随着水温升高，鱼的体温也会升高，同时鱼体内也会发生一系列变化，细胞内各种酶活性增强，各种生理生化反应随之增强，新陈代谢处于较高水平，耗氧量增加［22-23］。本实验结果表明：随着水温的升高，两种麻醉剂的麻醉和复苏时间均呈逐渐缩短趋势，这与张民强等［24］等用MS-222对斑点叉尾鮰（Ictalurus punctatus）的研究结果不同，其结果为随着温度的升高，斑点叉尾鮰的复苏时间明显延长。

暗纹东方鲀的最佳生存水温为18～27℃，属于暖水性鱼类，对麻醉剂更为敏感［25-26］，推测随着实验水温的逐渐升高，暗纹东方鲀的耗氧量上升，呼吸频率增加，与周围水体交换量增加，摄入相同含量的麻醉剂耗时会减少，所以麻醉时间会缩短，这与李乐等［27］采用 MS-222对硬头鳟（Oncorhynchus mykiss）幼鱼的研究结果相似；由于水温上升，体内谷丙转氨酶和谷草转氨酶等［28］都处在较高水平，肝脏对麻醉剂降解能力显著提升，因此，相应复苏的时间也会缩短。在复苏过程中观察发现，在高水温麻醉溶液中复苏后的暗纹东方鲀幼鱼活动力明显高于低水温麻醉溶液中的，但其内在机理还有待进一步研究。以上研究结果也表明，水温对鱼体麻醉及复苏效果的影响不仅与麻醉剂的种类有关，更与物种的差异性有关。

3.3 空气中不同暴露时间对深度麻醉暗纹东方鲀幼鱼复苏时间的影响

暗纹东方鲀幼鱼经130 mg·L-1的MS-222和60 mg·L-1的丁香酚深度麻醉后，随着在空气中暴露时间的延长，MS-222处理组幼鱼复苏时间先缩短后延长，与COYLE等［29］研究MS-222对美洲鲥（Alosa sapidissima）的结果不同，其原因可能是美洲鲥应激性强，耗氧量大，对麻醉剂等外界刺激极为敏感。丁香酚处理组幼鱼复苏时间随暴露时间延长而逐渐延长，这与赵艳丽等［30］研究丁香酚对大黄鱼（Pseudosciaena crocea）的结果基本一致。

综上所述：MS-222和丁香酚对暗纹东方鲀幼鱼均具有良好的麻醉效果。结合实际情况，在暗纹东方鲀幼鱼标志放流过程中，建议在水温20～24℃时使用120～140 mg·L-1的MS-222进行麻醉，标记操作过程控制在25 min以内；由于使用丁香酚麻醉后的幼鱼在空气中的可暴露时间较短，因此不建议采用。若在养殖、生产运输等其他领域，MS-222和丁香酚则均可选择。本研究结果为暗纹东方鲀幼鱼养殖、放流等研究中麻醉剂的合理使用提供了科学依据和技术支撑。麻醉是一个相对复杂的过程，鱼体的大小、体质量和水体盐度、pH等都会对其效果产生影响。同时，麻醉剂对鱼体耗氧率、排氨率、激素及酶活性等的影响还有待于进一步研究。