林蛙油提升雌激素的机制研究

赵宏宇,王 玉,刘新宇,宋莲莲,史顶聪,邸 琳

(吉林省中医药科学院,吉林长春 130012)

林蛙油为中国林蛙输卵管干制品,我国自宋朝时期就有使用林蛙油的记载,是珍贵的保健品。林蛙油味甘咸、性平、归肾、肺经,具有益精补肾、滋阴润肺的功效[1]。现代科学研究表明,林蛙油在抗疲劳、抗氧化、抗衰老、增强免疫力方面有一定的功效[2-5],女性使用后在改善围绝经期症状方面有很好的效果[6-7]。林蛙油在改善女性健康方面的作用很可能来自于其提升雌激素的作用,在林蛙油治疗绝经后骨质疏松症的报道中[8],患者虽然未能提高骨密度,但血清雌二醇含量却提升了1倍。很多动物实验也报道服用林蛙油后,动物血清雌二醇含量显著上升[9-10]。关于林蛙油提升血清雌激素的作用机制,目前主流观点认为是外源性地摄入了林蛙油中的雌激素,从而提升了服用者体内的雌激素含量。目前通过液相色谱法检测到林蛙油中雌二醇含量大约在3～7.65 μg/g[11-12],因林蛙油产地差异和雌二醇提取方式不同,林蛙油中雌二醇含量有一定差异。但关于外源激素制备大鼠高雌激素血症模型的研究[13-14]表明,大鼠长时间每日肌肉注射苯甲酸雌二醇1000 μg/kg以上,显著性提高大鼠血清雌二醇含量。根据林蛙油中雌二醇含量推算,大鼠灌胃大剂量林蛙油获得的雌二醇不足2 μg/kg,而且与肌肉注射相比,雌二醇通过口服途径效力会进一步降低。从外源激素机制考虑,林蛙油中的雌二醇不足以将服用者血清雌二醇含量显著提升。因此推测林蛙油提升服用者的血清雌激素,不是单纯依靠外源摄入林蛙油中的雌激素,而是有作用于性腺轴中“垂体-卵巢”部分的内源途径。为验证这一推测,设计了本次实验,同时灌胃大剂量林蛙油给正常大鼠和去卵巢大鼠,观察性激素和卵巢、子宫的组织学变化,希望通过本研究初步了解林蛙油提升服用者血清雌激素的机制是否基于调节服用者卵巢功能。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

WISTRA雌性大鼠(实验动物质量合格证号:NO.201800020868,实验动物生产许可证号:SCXK(吉)-2016-0003,60只,体质量200～230 g) 长春市亿斯实验动物技术有限责任公司,由吉林省中医药科学院实验动物伦理委员会审核通过,符合实验动物伦理委员会规定;林蛙油 购于吉林省白山市,经吉林省中医药科学院邸琳主任药师鉴定为中国林蛙(Rana temporaria chensinesis David)雌蛙输卵管干制品;雌二醇、孕酮、促黄体生成素、促卵泡生成素、睾酮、泌乳素测定试剂盒(化学发光免疫分析法) 郑州人福博赛生物技术有限责任公司。

Smatr3000型科斯迈全自动化学发光免疫仪 重庆科斯迈生物科技有限公司;BXM-30R型立式压力蒸汽灭菌器 上海博讯实业有限公司医疗设备厂;HC-3618R型高速冷冻离心机 安徽中科中佳科学仪器有限公司;JA2003B型千分之一电子天平 上海越平科学仪器有限公司;Y-2000型电子天平 常熟双杰测试仪器厂;九阳L18-Y928型搅拌机 九阳股份有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 动物去势模型制备及分组 雌性WISTAR大鼠随机选取20只分为2组,分别为正常对照组和正常+林蛙油组。其余大鼠,以戊巴比妥钠40 mg/kg腹腔注射麻醉,肋骨下沿至骨盆上沿位置除毛备皮,碘伏消毒,在距离肋骨下沿2 cm,距离脊柱2 cm的脊柱两侧,分别切开1 cm大小皮肤层切口,从皮肤切口下操作,切开小于1 cm的腹腔壁肌肉层切口,切口视野达到腹腔,拉出卵巢脂肪团,结扎卵巢与子宫连接部,摘除双侧卵巢,腹腔壁肌肉层和皮肤层分层缝合,消毒伤口。术后及连续3 d,肌注青霉素(4×104U/kg),以防感染。术后大鼠饲养15 d,选取伤口完全愈合、体重增长、外观状态良好的20只大鼠随机分为两组,分别为去势对照组和去势+林蛙油组。

1.2.2 林蛙油灌胃溶液的制备及给药 林蛙油在水中泡发后膨胀度大于55,且其高浓度的水溶液呈果冻状[15],不处理难以灌胃,吴朝霞等[16]研究发现以豆油作为溶剂溶解林蛙油粉末,可将林蛙油灌胃剂量提高10～20倍,但考虑到林蛙油古文记载的疗效和多数的科学研究中食用方法是以水泡发,因此仍然选择以水作为溶剂。每日称取林蛙油2～2.2 g置于100倍蒸馏水中4 ℃下泡发16 h,灌胃前搅拌机充分搅拌至可用灌胃器轻松吸取。正常+林蛙油组和去势+林蛙油组每日按20 mL/kg灌胃林蛙油水溶液,林蛙油灌胃剂量等于200 mg(生药)/kg,剂量换算相当于人每日服用2 g林蛙油。正常对照组和去势对照组每日灌胃同等体积的蒸馏水。连续灌胃4周。

1.2.3 动物处理及检测指标 大鼠末次灌胃1 h后以10%水合氯醛溶液3 mL/kg腹腔注射麻醉,腹主动脉采血,3000 r/min离心1 min分离血清备用;摘取子宫和卵巢(正常对照组和正常+林蛙油组的卵巢),称量器官湿重,计算器官指数;子宫和卵巢4%多聚甲醛固定,制作石蜡切片HE染色,400倍显微镜下进行组织切片检查;使用试剂盒,利用化学发光免疫分析法测定血清中雌二醇(E2)、孕酮(P)、卵泡生成素(FSH)、黄体生成素(LH)、睾酮(T)、泌乳素(PRL)的含量。

1.3 数据处理

2 结果与分析

2.1 服用林蛙油对大鼠血清雌二醇、孕酮、促黄体生成素、促卵泡生成素、睾酮、泌乳素含量的影响

结果如表1所示,血清雌二醇方面,与正常对照组相比,服用林蛙油的正常大鼠血清雌二醇含量显著上升(P<0.05),去势对照组大鼠血清雌二醇含量显著降低(P<0.05),与去势对照组相比,去势大鼠+林蛙油血清雌二醇含量无显著变化(P>0.05);血清孕酮方面,与正常对照组相比,服用林蛙油的正常大鼠血清孕酮含量有一定上升趋势,但没有统计学差异(P>0.05),去势大鼠血清孕酮含量显著降低(P<0.05),与去势对照组相比,去势大鼠+林蛙油血清孕酮含量无显著变化(P>0.05);血清促黄体生成素方面,正常+林蛙油组和去势+林蛙油大鼠组血清促黄体生成素含量都有一点下降的趋势,但各组间大鼠血清促黄体生成素含量比较无统计学差异(P>0.05);血清促卵泡生成素方面,与正常对照组相比,去势大鼠血清促卵泡生成素含量有一定下降趋势,但没有统计学差异(P>0.05),正常大鼠和去势大鼠+林蛙油后,血清促卵泡生成素含量有一定下降趋势,但没有统计学差异(P>0.05);血清睾酮方面,与正常对照组相比,服用林蛙油的正常大鼠血清睾酮含量显著上升(P<0.05),去势大鼠血清睾酮含量显著降低(P<0.05),与去势对照组相比,去势+林蛙油大鼠的血清睾酮含量显著上升(P<0.05);泌乳素方面,与去势对照组相比,去势大鼠+林蛙油的血清泌乳素含量显著上升(P<0.05),其它各组间大鼠血清泌乳素含量比较无统计学差异(P>0.05)。

表1 各组大鼠血清性激素含量Table 1 Content of serum sex hormone in all

注:*表示正常+林蛙油组、去势对照组与正常对照组比较，差异显著,P<0.05;#表示去势+林蛙油组与去势对照组比较，差异显著,P<0.05;表2、表3同。

表2 各组大鼠子宫、卵巢湿重及器官指数Table 2 The wet weight and organ index of ovary and uterus in all

雌二醇和孕酮的结果表明,服用林蛙油确实有提升正常大鼠血清雌激素的作用,但提升的机制应不同于外源雌激素机制,而考虑与卵巢功能调节相关。促黄体生成素和促卵泡生成素的结果表明,服用林蛙油后,正常大鼠和去势大鼠的两种促卵巢激素都出现受抑制的趋势,提示林蛙油中可能存在类似的促激素物质。睾酮和泌乳素的结果表明,服用林蛙油能提升正常大鼠和去势大鼠血清睾酮和泌乳素,考虑到去势大鼠服用后也有提升效果,这种作用方式可能类似外源激素,但本实验主要研究血清雌激素提升机制,因此没有继续考察。

2.2 服用林蛙油对大鼠子宫、卵巢湿重及器官指数的影响

结果如表2所示,去势后的大鼠子宫严重萎缩,湿重和子宫指数都显著低于正常对照组(P<0.05)。正常大鼠服用林蛙油后,子宫和卵巢的湿重和器官指数并没有发生明显的变化(P>0.05)。去势大鼠+林蛙油组的大鼠子宫湿重呈现出一定的增长趋势,但与去势对照组比较没有统计学差异(P>0.05)。

大鼠若长期给予外源雌激素以致机体内雌激素显著性升高情况下,子宫作为雌激素受体器官,一般会出现子宫指数的增加,而卵巢作为雌激素的分泌器官,功能受抑制,一般会出现卵巢指数降低[17-18]。本实验中,正常大鼠服用林蛙油后血清雌二醇显著上升,但各器官指数却没有显著的变化,并不符合使用外源雌激素的结果。

2.3 服用林蛙油对大鼠子宫、卵巢组织形态学的影响

如图1所示,正常对照组、正常+林蛙油组大鼠子宫粘膜上皮为单层柱状上皮,其下可见部分腺体,粘膜层内可见少许嗜酸性粒细胞,肌层为平滑肌细胞,外膜光滑。服用林蛙油后,组织形态无明显变化,子宫内膜上皮细胞厚度间比较也无显著差异(P>0.05),见表3;去势对照组大鼠子宫萎缩,体积变小,镜下可见子宫内膜呈单层立方上皮,腺体数量减少未见分泌,子宫间质萎缩,细胞稀疏;去势+林蛙油组大鼠子宫萎缩,体积变小,但相比于去势对照组,子宫内膜细胞层次增加,子宫内膜上皮细胞厚度增加,子宫内腺体数量增加,腺体内腺细胞数量和细胞厚度增加,子宫内膜上皮细胞厚度间比较有明显差异(P<0.05),见表3。

组别子宫内膜上皮细胞厚度(μm)正常对照组29.29±4.59正常+林蛙油组27.06±5.79去势对照组13.69±2.93去势+林蛙油组 20.16±6.66#

正常大鼠在服用林蛙油前后,子宫组织病理学检查中并没有出现明显的变化,子宫内膜上皮细胞厚度没有显著性的改变。在去势大鼠方面,由于没有了自身动情周期雌激素波动的影响,子宫内膜上皮细胞厚度增加更直接反映外源雌激素的作用[19],而且结合组织病理学检查,子宫的组织结构改善也支持林蛙油有一定外源雌激素的作用,但综合血清雌激素检测和子宫指数基结果,考虑林蛙油有较低的外源雌激素作用,但不足以提升机体的血清雌激素含量。

如图2所示,正常对照组大鼠卵巢切片镜下可见卵巢表面被覆薄层结缔组织膜,皮质内可见不同发育阶段的各级卵泡及黄体,卵泡周围为纤维结缔组织间质,髓质内可见大血管;正常+林蛙油组大鼠卵巢切片镜下与正常对照组接近,但观察到卵巢内黄体数量多于正常大鼠组卵巢中黄体数量。

图2 林蛙油对正常大鼠卵巢组织病理学的影响(400×)Fig.2 Effect of RO on ovary pathohistology of normal rats(400×)注:箭头所指分别为卵泡和新生成的黄体。

卵巢中卵泡排卵后形成黄体,黄体会大量分泌雌二醇和孕酮[20]。正常大鼠服用林蛙油后,组织病理学检查发现卵巢中黄体增多,与大鼠服用林蛙油后血清雌二醇、孕酮含量升高的实验结果相互支持,提示林蛙油确实有作用于性腺轴中“垂体-卵巢”部分的内源途径来提升机体雌激素。

3 讨论

大鼠血清雌二醇(E2)含量随着动情周期波动,一般在动情间期最低,在动情前期和动情期达到最高水平,而血清孕酮(P)含量一般在动情后期达到最高[21]。促黄体生成素(LH)是以脑垂体脉冲式分泌的方式进入血液,所以测定人类血清LH需在1 h内多次取血混合,以减小误差[22],本研究选择一次性的采血方式,LH的含量可能存在一定误差。本研究中所有大鼠同一天处理采集血清,并未统一所有大鼠处于相同的动情周期,在实际检测结果中,不论是否服用林蛙油,正常大鼠组内不同大鼠血清E2和P含量差异很明显,考虑可能处于不同动情周期。但同时发现,相比于正常对照组,正常+林蛙油组大鼠组内大鼠血清E2和P含量差异更大,这里推测正常大鼠服用林蛙油后,动情期时血清E2和P含量要升高更多。未来需进一步结合动情期考察,研究林蛙油提升雌激素机制以验证以上推测。

在本研究中,正常大鼠服用林蛙油后,卵巢组织病理学检查中观察到了较多排卵后黄体,康岚等[9]研究发现,服用林蛙油后大鼠卵巢中闭锁卵泡增多。一般在一个动情周期中,卵巢中会有很多卵泡生长发育,但只有数个卵泡能成熟、排卵,转变成黄体,其它未成熟的卵泡一般会在之前的阶段就停止发育,最终形成闭锁卵泡[23]。可以推测,服用林蛙油后,促使或激活了更多的卵泡生长发育,进而成熟的卵泡和闭锁的卵泡相应增多,成熟的卵泡增多导致排卵增多同时生成的黄体数目也增多了,而过多的卵泡和黄体都导致血清P和E2的含量明显上升。但是这个推测中林蛙油中起到这个作用的物质并不清楚,结合大鼠血清LH和促卵泡生成素(FSH)含量都有一定降低趋势,林蛙油促卵泡功能物质应不是作用于下丘脑和垂体,而是直接作用于卵巢,且不是LH、FSH的激素,曾考虑一种已用于促排卵药的物质-绒毛膜促性腺激素(HCG),陈晓平等[24]检测林蛙油中HCG含量达到了107.5 μg/g,1 g林蛙油中的HCG含量接近于1个HCG国际单位,但此剂量不足以达到促卵泡发育的作用。林蛙油是雌性林蛙的排卵前膨大的输卵管,由于林蛙是两栖动物,且其繁育后代是将未受精的卵排到水中,进行体外受精,输卵管中的物质此刻将作为包裹受精卵的物质,作为提供卵子发育成熟乃至受精卵发育的环境物质[25],其中具有某些促卵泡发育的激素是一个比较合理的推测,或许因为两栖动物和哺乳动物物种不同,促性腺激素的结构有一定差异,并没有被检测出,但在服用者体内可以发挥作用。总体而言,想要明确物质基础难度较大,没有足够的证据能证实这个推测,需要进一步的研究探索。

林蛙油的安全性一直是大家关心的问题[26]。外源雌激素改变内分泌会使年轻女性皮肤状态更好,使更年期女性围绝经期综合征症状改善,但同时患子宫肌瘤甚至宫颈癌等妇科疾病概率也会增加[27-28]。服用林蛙油一直被认为是补充外源雌激素,因此林蛙油是否有外源雌激素同样的安全性问题也是很多实验室的关注点。有研究发现[12],小鼠长期服用林蛙油后,子宫组织中的TβR-I、TβR-II(和子宫内膜癌相关)的表达并没有显著变化,反而卵巢组织中的FSHR(和卵巢早衰、卵巢癌相关)表达增高,该研究结果与本研究的推测相符,服用林蛙油更多是刺激卵巢功能。研究林蛙油安全性问题,建议关注其对卵巢的过度刺激及卵巢早衰。

4 结论

本研究中正常大鼠服用林蛙油后,血清E2和T含量显著升高,子宫组织检查未观察到显著变化,卵巢组织观察到黄体增多。去势大鼠服用林蛙油后血清E2含量无明显变化,T和RPL含量显著升高,子宫组织检查中发现子宫内膜上皮细胞厚度显著增加,且子宫细胞层次状态有改善。综上考虑林蛙油提升服用者雌激素机制可能类似促性腺激素刺激卵巢中卵泡发育,同时也具有一定的外源激素作用。