刺玫果总黄酮Zn2+络合物的制备及其体外抗氧化活性研究

,2,*

(1.吉林化工学院化学与制药工程学院,吉林吉林 132022;2.吉林大学化学学院,吉林长春 130000)

山刺玫属于喜光的蔷薇科小灌木,主要生长在杂木林及山坡灌木中,其果实称为刺玫果,广泛分布于东北及内蒙、山西等省[1]。山刺玫富含黄酮类[2]、鞣质类[3]、皂苷类[4]、总三萜酸[5]等活性成分。其所含总黄酮类具有减慢心率、抑制离体心房收缩[6]、延长凝血时间、抑制血栓形成的作用[7],可用于预防和治疗高血脂、血栓所致的心脑血管疾病[8]。

现阶段对刺玫果的研究主要集中于其自身所含物质,并无太多拓展。当代食品的开发与利用多结合新型技术来实现绿色食品的生产与经营,故本文利用黄酮类化合物具有较高的超离域度、完整的大π键共轭体系、强配体氧原子与合适的空间构型,可与金属离子形成良好的螯合物这一特性,得到新的黄酮络合物。配位化合物是一类由配体和中心金属原子以配位键结合,按一定的组成和空间构型所形成的化合物。金属络合物在生命过程中起着十分重要的作用,这可以作为新食品研制的一个重要方向,从而得到更加优良的新型食物[9-10]。这为刺玫果的进一步开发利用提供了依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

刺玫果总黄酮 实验室自制;芦丁标准品 成都曼思特生物科技有限公司;D-101大孔树脂 西安蓝晓科技新材料股份有限公司;其他试剂 均为国产分析纯。

TU-19紫外-可见光光度分析仪 北京普析通用仪器有限责任公司;FA2004N喷雾干燥器 上海精密科学股份有限公司;H1850离心机 湖南湘仪实验室仪器开发有限公司;W5-100SP型恒温水浴锅 上海申生科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 刺玫果总黄酮的制备 称取刺玫果干粉适量,加入6倍量的75%乙醇水溶液,于85 ℃条件下加热回流3次,每次5.0 h[11],制得粗提物。再通过D-101大孔树脂,加入上柱液浓度为0.025 g/mL(相当于原生药),上样量0.24 g/g(生药量:树脂量),体系pH为2.0～4.0,树脂径高比为1∶3,先静置30 min,然后以1 BV/h流速进行吸附,之后用3 BV蒸馏水以3 BV/h进行洗脱,再用4 BV的70%乙醇水溶液以1 BV/h的流速洗脱[12],制得刺玫果总黄酮。

1.2.2 样品中总黄酮含量的检测 称取刺玫果精提物0.16 g,用60%乙醇溶液定容至250 mL容量瓶中,过滤,取续滤液1 mL于25 mL容量瓶中,在30 ℃水浴下,加入5% NaNO2溶液1.0 mL,摇匀,放置6 min,加入10% Al(NO3)3溶液1.0 mL,摇匀,放置6 min,加4% NaOH溶液10 mL,再加入60%乙醇溶液,定容,放置15 min,以不加显色剂的供试液为空白,于505 nm处测吸光度A。根据以芦丁为对照品,得到标准曲线A=11.868C+0.0035,R2=0.9994(A为吸光度值,C为芦丁质量浓度mg/mL),并计算样品中的总黄酮含量[12]。

1.2.3 刺玫果总黄酮Zn2+络合物的制备

1.2.3.1 单因素实验 氯化锌浓度的影响：称取干燥的刺玫果总黄酮适量，甲醇溶解，定性滤纸过滤，配制成总黄酮质量浓度为4 mg/mL的供试品溶液各50 mL，置于6个具塞锥形瓶中，在25 ℃下，边搅拌边缓慢加入质量浓度分别为4、6、8、10、12、14 mg/mL氯化锌溶液25 mL，用4% NaOH溶液调节溶液pH为7，以30 r/min的频率恒温振荡2.0 h，10000 r/min离心10 min，测定上清液中总黄酮质量浓度，收集沉淀得到刺玫果总黄酮Zn2+络合物，根据反应前后溶液中总黄酮质量浓度计算黄酮转化率。

pH的影响：以最优氯化锌浓度进行试验，其他条件同上，考察pH分别为6、7、8、9、10、11对黄酮转化率的影响。

总黄酮溶液质量浓度的影响：以最优氯化锌浓度、pH进行试验，其他条件同上，考察总黄酮溶液质量浓度4、6、8、10、12、14、16 mg/mL对黄酮转化率的影响。

溶剂的影响：以最优氯化锌浓度、pH、总黄酮溶液质量浓度进行试验，其他条件同上，考察分别用甲醇、30%、50%、70%、95%乙醇、无水乙醇溶解刺玫果总黄酮对黄酮转化率的影响。

反应温度的影响：以最优氯化锌浓度、pH、总黄酮溶液质量浓度、溶剂进行试验，其他条件同上，考察不同反应温度25、40、60、80、95 ℃水浴对黄酮转化率的影响。

反应时间的影响：以最优氯化锌浓度、pH、总黄酮溶液质量浓度、溶剂、反应时间进行试验，考察恒温振荡器中振荡1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 h对黄酮转化率的影响。

其中，黄酮转化率的计算公式为：

黄酮转化率(%)=[(C0V0-C1V1)/C0V0]×100

式中:C0为络合反应前黄酮质量浓度;V0为络合反应前溶液体积;C1为络合反应后黄酮质量浓度;V1为络合反应后溶液体积。

1.2.3.2 正交试验 根据单因素实验结果,选择总黄酮溶液质量浓度(A)、氯化锌质量浓度(B)、反应温度(C)、pH(D)四个因素进行正交试验。正交试验因素水平表见表1。

表1 正交试验因素水平表Table 1 Factors and levels table of orthogonal experiment

1.2.3.3 工艺稳定性验证试验 称取适量干燥的刺玫果总黄酮,用无水乙醇溶解,过滤,配制成总黄酮质量浓度为8 mg/mL的供试品溶液50 mL,置于具塞锥形瓶中,在50 ℃的水浴中,边搅拌边缓慢加入质量浓度为14 mg/mL的氯化锌溶液25 mL,用4% NaOH溶液调节溶液pH为9,恒温震荡3.0 h,离心,测定上清液中总黄酮质量浓度,收集沉淀得到刺玫果总黄酮Zn2+络合物,根据反应前后溶液中黄酮浓度计算黄酮转化率,重复三次上述试验。

1.2.4 傅立叶红外光谱 分别称取适量干燥的刺玫果总黄酮提取物、总黄酮Zn2+络合物,与KBr混合研磨后压片,测定红外光谱,扫描范围:400～4000 cm-1。

1.2.5 体外抗氧化性试验

1.2.5.1 对羟基自由基(·OH)的清除能力 分别吸取不同质量浓度的刺玫果总黄酮溶液及其Zn2+络合物溶液、VC溶液各适量,按照参考文献[13]中的试验方法,以二甲基亚砜作参比,在536 nm处测其吸光度值AP、As、Ab。供试液对·OH的清除率(η·OH)按公式(1)计算[13],并计算IC50。

η·OH(%)=(AS-AP)/(Ab-AP)×100

式(1)

式中:AP-加入邻二氮菲、蒸馏水、硫酸亚铁、0.1% H2O2的吸光度值,As-加入邻二氮菲、供试液、硫酸亚铁、0.1% H2O2的吸光度值,Ab-加入邻二氮菲、蒸馏水、硫酸亚铁的吸光度值。

式(2)

式中:A1-加入Tris-HCl缓冲液、供试液、邻苯三酚的吸光度值,A2-加入Tris-HCl缓冲液、供试液、蒸馏水的吸光度值,A3-加入Tris-HCl缓冲液、蒸馏水、邻苯三酚的吸光度值。

1.2.5.3 抗脂质体过氧化作用试验 分别取不同质量浓度的刺玫果总黄酮溶液及其Zn2+络合物溶液、VC各适量,按照参考文献[15]中的试验方法,在535 nm处测定吸光度Ac、As。供试液对脂质体过氧化抑制率按公式(3)计算[15]。并计算IC50。

抑制率(%)=[(Ac-As)/Ac]×100

式(3)

式中:As-加入卵磷脂、硫酸亚铁、供试液、三氯乙酸(TCA)-硫代巴比妥酸(TBA)-盐酸(HCl)混合液的吸光度,Ac-加入卵磷脂、硫酸亚铁、蒸馏水、TCA-TBA-HCl混合液的吸光度。

1.2.5.4 对ABTS自由基阳离子(ABTS+·)的清除能力 将浓度为7 mmol/L的ABTS溶液和浓度为2.45 mmol/L的过硫酸钾溶液等体积混合,于23 ℃避光反应12～16 h,制备ABTS+·基液。然后用蒸馏水稀释基液(40～50倍)至其在波长734 nm处吸光度(A空白)为0.705,制得ABTS自由基阳离子工作液。分别吸取不同质量浓度的供试品溶液(刺玫果总黄酮溶液及其Zn2+络合物),置于10 mL具塞试管中,加入3.9 mL上述工作液混合,于23 ℃避光反应6 min,以蒸馏水作空白,于734 nm波长处测其吸光度值A。VC作对照,将VC用蒸馏水配成对照溶液,同法操作。供试品溶液对ABTS+·的清除率(ηABTS+·)按公式(4)计算[16],并计算IC50。

ηABTS+·(%)=(A空白-A)/A空白×100

式(4)

式中:A空白-加入ABTS自由基阳离子工作液,蒸馏水,A-加入ABTS自由基阳离子工作液,供试品溶液。

1.3 数据处理

每组实验至少重复3次,结果均以“平均值±标准差”,实验数据使用Origin 8.0进行整理和作图。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

2.1.1 氯化锌浓度的影响 由图1(a)可知,在氯化锌浓度小于12 mg/mL时,随着浓度的增加,转化率提高,在12 mg/mL时达到最大,继续增加浓度,转化率不再提高。分析其原因可能是因为在12 mg/mL之前,溶液中的黄酮类物质未反应完全,故随着金属离子的加入而继续反应,在12 mg/mL时,几乎反应完全,之后继续加入金属离子转化率不再升高。综合考虑,加入的氯化锌浓度为12 mg/mL进行后续实验。

2.1.2 pH的影响 由图1(b)可知,体系pH在8时,转化率最大,小于8时,随着pH的增加转化率提高,大于8时,转化率反而下降。分析其原因可能是因为随着溶液碱性的加强,黄酮类物质反应活性加大,当继续加入碱时,部分黄酮类物质结构发生转变,导致转化率降低。综合考虑,选择pH8、9、10进行后续实验。

2.1.3 总黄酮溶液溶度的影响 由图1(c)可知,在总黄酮浓度为6 mg/mL时,转化率最大,逐渐增加浓度反而使转化率下降。分析其原因可能是因为在6 mg/mL时,黄酮类物质与金属离子反应几乎完全,随着浓度的继续增加,反应不再进行,使得转化率下降。综合考虑,黄酮溶液浓度为6 mg/mL进行后续实验。

2.1.4 溶剂的影响 由图1(d)可知,使用无水乙醇作为溶剂时,转化率最大。分析其原因可能是因为黄酮类物质中黄酮苷元含量较多,更容易溶于有机溶液中。综合考虑,溶剂为无水乙醇进行后续实验。

2.1.5 反应温度的影响 由图1(e)可知,随着反应温度的升高转化率逐渐提高,在60 ℃达到最大值,继续增加温度反而使转化率下降。分析其原因可能是因为,随着温度的提高,分子的扩散速度增快,有利于络合物的形成,但是随着温度的再提高,部分黄酮类物质结构发生变化。综合考虑,选择反应温度为60 ℃进行后续实验。

2.1.6 反应时间的影响 由图1(f)可知,随着反应时间的增加,转化率不断提高,在达到3.0 h时,转化率达到最大值,继续增加时间,转化率降低。分析其原因可能是因为在3.0 h时,反应几乎完全,在此之前,反应时间短,未能充分反应,在此之后,反应时间太长,黄酮类物质结构发生转变。综合考虑,选择反应时间为3.0 h。

图1 不同条件对刺玫果总黄酮Zn2+络合物制备的影响Fig.1 Effect of different conditions on the preparation of total flavonoids Zn2+ complexes

2.2 正交试验结果

正交试验设计及结果分析见表2。由表2可知,总黄酮溶液质量浓度(A)、氯化锌溶液质量浓度(B)、反应温度(C)、pH(D)对刺玫果总黄酮金属络合物的制备均有一定的影响,影响大小顺序为D>B>A>C,即pH>氯化锌溶液质量浓度>总黄酮溶液质量浓度>反应温度,最佳提取条件为A3B3C1D2,即总黄酮溶液质量浓度为8 mg/mL,氯化锌氯化锌溶液质量浓度为14 mg/mL,反应温度为50 ℃,pH为9。

表2 正交试验设计及结果Table 2 Design and results of orthogonal experiment

2.3 工艺稳定性验证试验结果

根据反应前后溶液中黄酮浓度计算黄酮转化率分别为96.68%、97.20%、96.94%,平均为96.94%,RSD为0.27%;收集沉淀得到刺玫果总黄酮Zn2+络合物,称其质量得收率分别为35.39%、35.39%、36.51%,平均为35.76%,RSD为1.81%。说明该方法稳定可行。

2.4 红外光谱结构表征及分析

如图2所示,刺玫果总黄酮在3384 cm-1处为-OH特征吸收峰,与Zn2+络合后此峰左移至3404 cm-1且由宽峰变窄,说明Zn2+与羟基有配位作用,Zn2+吸电子作用使酚羟基上的H游离[17]。1612 cm-1处为C=O吸收峰,从图2中可以看出,此处峰的强度明显降低,说明Zn2+与刺玫果总黄酮中C=O基有配位作用。1074 cm-1处为芳基烷基醚C-O-C的吸收峰,在总黄酮Zn2+络合物谱图中此峰变弱,这是由于与Zn2+配位使苯环π电子向环外转移[18]。红外光谱分析表明,Zn2+与刺玫果总黄酮发生了络合,形成了络合物。

图2 刺玫果总黄酮及其Zn2+络合物红外光谱图Fig.2 Infrared spectrum of total flavonoids and Zn2+ complexes

2.5 体外抗氧化性试验结果

2.5.1 对羟基自由基(·OH)的清除能力 由图3可知,刺玫果总黄酮(a)、Zn2+络合物(b)和VC(c)对·OH的清除率都随着其各自质量浓度的增加而增加。通过拟合方程可得:刺玫果总黄酮的IC50为1.30 mg/mL,Zn2+络合物的IC50为0.78 mg/mL,VC的IC50为1.63 mg/mL。由此可以看出,Zn2+络合物对·OH的清除能力最大,其次是刺玫果总黄酮,VC最差。

图5 刺玫果总黄酮(a)、Zn2+络合物(b)和VC(c)的抗脂质体过氧化能力Fig.5 Anti-liposome peroxidation capacity of total flavonoids(a),Zn2+ complexes(b)and VC(c)

图3 刺玫果总黄酮(a)、Zn2+络合物(b)和VC(c)对·OH的清除能力Fig.3 Scavenging ability of total flavonoids(a),Zn2+ complexes(b)and VC(c)on ·OH

图4 刺玫果总黄酮(a)、Zn2+络合物(b)和VC(c)对的清除能力Fig.4 Scavenging ability of total flavonoids(a),

图6 刺玫果总黄酮(a)、Zn2+络合物(b)和VC(c)对ABTS+·的清除能力Fig.6 Scavenging ability of total flavonoids(a),Zn2+ complexes(b)and VC(c)on ABTS+·

2.5.3 抗脂质体过氧化作用试验结果 由图5可知,刺玫果总黄酮(a)、Zn2+络合物(b)、VC(c)对抗脂质体过氧化能力都随着其各自质量浓度的增加而增加。通过作拟合方程可得:刺玫果总黄酮的IC50为4.82 mg/mL,Zn2+络合物的IC50为1.78 mg/mL,VC的IC50为7.12 mg/mL。由此可以看出,Zn2+络合物的抗脂质体过氧化能力最强,刺玫果总黄酮次之,而VC能力最差。

2.5.4 对ABTS自由基阳离子(ABTS+·)的清除结果 由图6可知,刺玫果总黄酮(a)、Zn2+络合物(b)、VC(c)对ABTS自由基阳离子(ABTS+·)的清除能力都随着其各自质量浓度的增加而增加。通过作拟合方程可得:刺玫果总黄酮的IC50为0.06 mg/mL,Zn2+络合物的IC50为0.57 mg/mL,VC的IC50为0.08 mg/mL。由此可以看出,刺玫果总黄酮对ABTS+·的清除能力最大,其次是VC,最后是Zn2+络合物。

3 结论