西兰花茎叶蛋白酶解条件优化及其降血脂活性

,*

(1.集美大学食品与生物工程学院,福建厦门 361021;2.集美大学水产学院,福建厦门 361021)

西兰花(Brassicaoleracea)又名青花菜,为十字花科芸薹属植物,营养丰富,具有很高的食用价值[1]。我国西兰花产量居世界前列,目前已实现国内周年生产,各地的生产季节相互交叉[2],但除可食用的花球部分,产生大量西兰花茎叶等副产物,除少部分作为饲料外,大部分在田里腐败,引起空气污染及水体富营养化等环境问题[3]。

研究表明,西兰花富含蛋白质、维生素及矿物质等营养成分,以及膳食纤维、类黄酮和萝卜硫素等功能成分,具有抗氧化[4]、抗肿瘤[5]、增强免疫力[6]等活性,经常食用可降低某些癌症、心血管疾病和糖尿病的发病率[7-9]。目前,关于西兰花营养成分的研究较多,Thejass等[10]报道了西兰花中萝卜硫素增强小鼠免疫活性,Reis等[11]分析了西兰花中类胡萝卜素、类黄酮、多酚等化合物的抗氧化活性,Mandimika等[12]的研究表明西兰花膳食纤维能够降低大鼠血脂。在西兰花茎叶常规营养成分中,蛋白含量占干物质20%以上[13],是极好的植物蛋白资源,有广阔的开发利用前景。

我国城市居民疾病死亡率最高的是心脑血管疾病[14],高血脂是心脑血管疾病的主要影响因素。膳食中的功能活性物质对高血脂疾病有良好的预防作用,尤其是植物蛋白源类物质[15],文献相继报道大豆[16-17]、大米[18]、大蒜[19]等植物蛋白具有降血脂的功能。本文用胰蛋白酶酶解西兰花茎叶蛋白,通过膜分离和冷冻干燥,得到西兰花茎叶蛋白肽,并对其降小鼠血脂活性进行研究,以期为西兰花茎叶蛋白开发利用提供研究基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

西兰花茎叶蛋白浆 浙江台州天莱生物科技有限公司,西兰花茎叶蛋白浆经真空冷冻干燥后,储存在干燥的环境中待用(干物质蛋白含量46.34%);胰蛋白酶(酶活为75623 U/g 源叶生物科技有限公司;细胞色素C、胰岛素、杆菌肽、氧化型谷胱甘肽、Gly-Gly-Gly(甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸) 美国Sigma-Aldrich公司;小鼠普通饲料 北京华阜康公司;小鼠高脂饲料 自行配制[20-21](猪油15%、蔗糖20%、胆固醇1.2%、胆酸钠0.2%、基础饲料63.6%);甘油三酯(TC)检测试剂盒、总胆固醇(TG)检测试剂盒、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)测试盒、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)测试盒、谷丙转氨酶(ALT)检测试剂盒、谷草转氨酶(AST)检测试剂盒 南京建成生物工程研究所;SPF级KM种雄性小鼠 许可证号:SCXK(京)2014-0004 北京华阜康公司。

JDC-0.2真空冷冻干燥机 北京博医康实验仪器有限公司;CeraMem0100陶瓷膜小型设备、RNF0460多功能卷式膜小型设备 厦门福美科技有限公司;ULTMATE3000高效液相色谱仪 美国赛默飞公司;3K30冷冻高速离心机 德国Sigma公司;迈瑞BS-240vet全自动生化分析仪 迈瑞医疗国际有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 西兰花茎叶蛋白酶解条件的优化

1.2.1.1 西兰花茎叶蛋白酶解工艺流程 西兰花茎叶蛋白浆冻干粉末→加入适量的水→调节溶液pH至酶最适pH→加入适量的蛋白酶→在酶最适温度下进行酶解→95 ℃灭酶20 min→制备西兰花蛋白肽

1.2.1.2 响应面法优化酶解条件 在单因素实验基础上,固定胰蛋白酶酶解时间为3 h,以水解度为响应值,分析pH、酶解温度、加酶量和底物浓度(固形物浓度)对胰蛋白酶水解西兰花茎叶蛋白效果的影响建立四因素三水平的Box-Behnken中心组合实验。其响应面因素水平表如表1所示:

表1 响应面分析因素及水平表Table 1 Factors and level tables of response surface analysis

1.2.1.3 蛋白水解度的测定 用甲醛滴定法[22]测定水解液的氨基氮含量,凯氏定氮法[23]测定样品中蛋白质含量,通过式(1)计算水解度。

水解度DH(%)=C×(V1-V0)×0.014×m/(5×M)×100

式(1)

式中:C:NaOH浓度(mol/L),V1:样品在加入甲醛后消耗NaOH标准溶液体积(mL),V0:空白在加入甲醛后消耗NaOH标准溶液体积(mL),m:酶解液氨基氮质量(mg),M:样品总氮质量(mg)。

1.2.2 HPLC测定西兰花茎叶蛋白酶解产物蛋白肽分子量分布 参考国标GB/T 22729-2008。采用TSKgel G2000SWXL(7.8 mm×300 mm)凝胶色谱柱。流动相:乙腈∶超纯水∶TFA=45∶55∶0.1 (V∶V),流速:0.5 mL/min,检测波长:220 nm,柱温:30 ℃。

校正曲线用的标准品:细胞色素C(MW12384 Da)、胰岛素(MW 5777.54 Da)、杆菌肽(MW1422.69 Da)、氧化型谷胱甘肽(MW612.64 Da)、Gly-Gly-Gly(MW189.17 Da)。

1.2.3 西兰花茎叶蛋白肽酶解产物的制备 西兰花茎叶蛋白浆→胰蛋白酶水解(优化后的条件)→200 nm孔径陶瓷滤膜(进膜压力3 bar,循环流量80 LPM,25 ℃),取透过液→200 Da孔径卷式膜(进膜压力25 bar,循环流量25 LPM,25 ℃),取截留液→冷冻干燥→西兰花茎叶蛋白肽

1.2.4 小鼠降血脂活性的研究

1.2.4.1 实验动物分组及给药 参考禇斌杰[24]方法稍作修改。KM种雄性小鼠进行适应性饲养一周,将小鼠分为10只∕组,共6组,分别为空白对照组、阳性对照组(辛伐他汀)、模型对照组和西兰花茎叶蛋白酶解产物低、中、高剂量组,空白组小鼠喂基础饲料,其他组小鼠喂高脂饲料。每日定时灌胃体积为10 mL/(kg·BW),低、中、高灌胃剂量分别为300、600、1200 mg/(kg·d),阳性对照剂量为8 mg/(kg·d),另外两组灌胃等体积双蒸水。连续灌胃4周,期间每周称量小鼠体重并按实际体重调整灌胃体积。末次灌胃后,禁食过夜,次日取血。

1.2.4.2 血脂水平测定 测定项目:血清甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)。

各项指标的测定按照南京建成生物工程研究所的相应测试盒的说明书进行。

1.2.4.3 AI指数的计算 动脉硬化指数(arteriosclerosis index,AI)根据式(2)计算[25]:

动脉硬化指数(AI)=(TC-HDL-C)/HDL-C

式(2)

式中:TC:根据测试盒用全自动生化分析仪测出的总胆固醇含量(mmol/L);HDL-C:根据测试盒用全自动生化分析仪测出的高密度脂蛋白胆固醇含量(mmol/L)。

1.3 数据处理

2 结果与讨论

2.1 西兰花茎叶蛋白胰蛋白酶水解条件的优化

在单因素实验基础上,以水解度为响应值,选择pH、酶解温度、加酶量和底物浓度,建立四因素三水平的响应面试验。实验设计及结果如表2所示。

表2 响应面试验设计及结果Table 2 Design and results of response surface experiment

运用Design-Expert.8.0.6.1实验设计软件对实验结果进行多元拟合分析,得到胰蛋白酶对pH(A)、温度(B)、底物浓度(C)和加酶量(D)的二次多元回归方程:Y=19.34+0.62A+1.22B+4.39C+0.69D+0.050AB-1.96AC+1.25AD-1.06BC+0.14BD+0.035CD-1.16A2-0.81B2-0.72C2-0.42D2,R2=0.9885。根据实验软件所得实验结果可知,模型具有较高的F值和较低的P值(P<0.01),说明该模型具有较高的相关性,且失拟项为0.0789,不显著,表明所建立的回归模型能够应用于理论预测[26]。回归方程的各项方差分析表明,A、B、C、D、AC、AD、BC、A2、B2、C2对水解度有极显著的影响(P<0.01),各因素对胰蛋白酶水解西兰花茎叶蛋白的影响主次顺序为:底物浓度(C)>温度(B)>加酶量(D)>pH(A)。

图1采用Design-Expert 8.06软件作图,当pH、温度、底物浓度、加酶量任意两个因素取零水平时,剩余的两个因素对水解度的影响，由响应面陡峭程度及等高线可知，pH与底物浓度(AC)、pH与加酶量(AD)、温度与底物浓度(BC)的交互作用影响显著。由图(a)可知,当pH不变时,随着底物浓度的升高,水解度逐渐升高,上升趋势较明显;而底物浓度不变时,随着pH的升高,水解度先升高后下降,趋势较缓慢,说明与pH相比,底物浓度为主要影响因素。由图(b)可知,当加酶量不变时,随着pH的增大,水解度表现出先缓慢上升后逐渐下降的趋势,趋势较陡;当pH不变时,随着加酶量的增加,水解度逐渐上升,上升趋势较明显,表明与pH相比,加酶量为主要影响因素。由图(c)可知,当温度一定时,水解度随着底物浓度的增加逐渐增大,有较明显的趋势;当底物浓度一定时,随着温度的升高,水解逐渐增大,但趋势较缓慢,因此相对于温度,底物浓度为主要影响因素。

表3 方差分析Table 3 Analysis of variance

图1 因素间相互作用的响应面图Fig.1 Response surface diagram of the interaction between factors

经过Design Expert 8.0.6.1软件对实验数据的分析优化后得到胰蛋白酶对西兰花茎叶蛋白酶解的最优条件为pH7.5、酶解温度50 ℃、加酶量2000 U/g、底物浓度4.0%,此条件下胰蛋白酶实际水解度为22.37%±0.46%,与理论水解度23.40%基本一致。

2.2 西兰花茎叶蛋白酶解物中蛋白肽分子量分布

本实验以细胞色素C(MW12384 Da)、胰岛素(MW5777.54 Da)、杆菌肽(MW1422.69 Da)、氧化型谷胱甘肽(MW612.64 Da)、Gly-Gly-Gly(MW189.17 Da)为标准品,通过标准品的洗脱时间和相对分子质量来测定酶解产物的分子量分布。其中细胞色素C的洗脱时间为11.90 min,胰岛素为14.13 min,杆菌肽为15.86 min,氧化型谷胱甘肽为19.01 min,Gly-Gly-Gly为19.85 min。西兰花茎叶蛋白酶解产物分子量分布如图2所示,以标准品的洗脱体积为横坐标,相对分子质量的对数值为纵坐标作图,如图3所示。Log(MW)与X(洗脱体积)成线性关系,对应的线性关系方程为Log(MW)=-0.4313X+6.6974,决定系数R2=0.9602,根据线性关系方程,发现西兰花茎叶蛋白酶解产物分子量主要集中在1000～3000 Da,占总数的64.35%。

图2 西兰花茎叶蛋白酶解产物分子量分布图Fig.2 Molecular weight distribution of proteolytic products of broccoli stems and leaves

图3 标准品的相对分子量对数与其洗脱体积之间的关系Fig.3 Relationship between the relative molecular weight of the standard and its elution volume

2.3 西兰花茎叶蛋白肽的降血脂活性

高脂血症可引起动脉粥样硬化、冠心病、心肌梗塞和脑卒中等多种严重危害人体健康的疾病[27]。有研究报道了膳食蛋白在调节胆固醇代谢中有重要作用[28-30],尤其是大豆蛋白[31]、大米蛋白[32]等植物性蛋白作用明显,而大豆蛋白的酶解物表现出比未消化的蛋白质具有更高的降胆固醇活性[33],蛋白酶解产物可降低TC、TG、LDL-C含量和增加HDL-C含量[34-36]。

由图4～图7可知,本研究发现,西兰花茎叶蛋白肽的剂量与降低小鼠血清TC、TG、LDL-C含量之间呈现良好的量效关系,在300 mg/(kg·d)的灌胃剂量下,西兰花茎叶蛋白肽表现出一定的降血脂活性,在600、1200 mg/(kg·d)的灌胃条件下,TC、TG、LDL-C 含量与模型组有极显著差异(P<0.01),强于黑豆肽1000 mg/(kg·d)的有效灌胃剂量[37]。于TC、TG、LDL-C、HDL-C含量方面,模型组与空白组之间有极显著差异(P<0.01),与模型组相比,阳性对照组和低、中、高剂量组TC含量均有极显著差异(P<0.01),TC含量极显著降低(P<0.01);阳性对照组和中、高剂量组TG和LDL-C含量之间也有极显著差异(P<0.01),低剂量组TG和LDL-C含量与模型组存在显著差异(P<0.05),它们的TG和LDL-C含量均明显降低。由图7可知,阳性对照和低、中剂量组与模型组相比在HDL-C含量上有极显著差异(P<0.01),但高剂量组与模型组差异不显著(P>0.05),可能是因为高浓度样品使小鼠产生抗药性[38]。

图4 西兰花茎叶蛋白肽对小鼠TC含量的影响Fig.4 Effect of broccoli stem and leaf protein peptide on TC content in mice注:与空白组相比,##P<0.01;与模型组相比,*P<0.05,**P<0.01。图5～图10同。

图5 西兰花茎叶蛋白肽对小鼠TG含量的影响Fig.5 Effect of broccoli stem and leaf protein peptide on TG content in mice

图6 西兰花茎叶蛋白肽对小鼠LDL-C含量的影响Fig.6 Effect of broccoli stem and leaf protein peptide on LDL-C content in mice

图7 西兰花茎叶蛋白肽对小鼠HDL-C含量的影响Fig.7 Effect of broccoli stem and leaf protein peptide on HDL-C content in mice

动脉硬化指数(AI)是一个衡量动脉硬化程度的指标,AI越小，表明患动脉粥样硬化的可能性越小,它在预测冠心病的发生、发展和严重程度方面更优于non-HDL-C和LDL-C[39]。由图8可知,模型组与空白组有极显著差异(P<0.01),模型组AI指数明显上升。阳性对照组和低、中、高剂量组与模型组相比均有极显著差异(P<0.01),从低剂量到高剂量的AI指数呈现先下降后上升的趋势,表明灌胃剂量为600 mg/(kg·d)最利于小鼠AI指数的降低，其AI指数最为接近阳性对照组,但还是明显高于空白组,表明在中剂量时能有效降低AI,但不能恢复至正常水平,这与李汉臣等[40]的研究结果一致。

图8 西兰花茎叶蛋白肽对小鼠AI指数的影响Fig.8 Effect of broccoli stem and leaf protein peptide on AI index in mice

AST和ALT主要存在于肝脏的肝细胞内,当肝脏受损时,转氨酶会释放到血液中去,所以血液检测中转氨酶值会偏高[41]。ALT和AST是用来衡量肝脏功能的指标。由图9和图10可知,模型组与空白组之间有极显著差异(P<0.01),模型组的ALT和AST含量明显升高。阳性对照组和低、中、高剂量组与模型对照组相比在ALT含量上均有极显著差异(P<0.01),高剂量组降低ALT含量效果最为明显。在AST含量方面,低剂量组与模型组之间无显著差异;中、高剂量组与模型组之间有极显著差异(P<0.01),明显强于阳性对照组,表明西兰花茎叶蛋白肽在较高浓度下具有较好的降低AST含量的效果。高血脂易引起脂肪肝,脂肪肝常表现出AST异常,AST明显增加意味着可能有严重的肝细胞实质损害[42]。西兰花茎叶蛋白肽在低剂量时,小鼠体内AST含量与模型组之间无显著差异,在高剂量时血液中 AST和ALT含量降低明显,基本和空白组一致,表明西兰花茎叶蛋白肽能够在一定程度上降低由高血脂引起的肝细胞损伤。

图9 西兰花茎叶蛋白肽对小鼠ALT的影响Fig.9 Effect of broccoli stem and leaf protein peptide on ALT in mice

图10 西兰花茎叶蛋白肽对小鼠AST的影响Fig.10 Effect of broccoli stem and leaf protein peptide on AST in mice

3 结论

本实验以水解度为指标,在单因素的基础上通过 Box-Behnken 实验和回归分析,得出胰蛋白酶酶解西兰花茎叶蛋白的最佳工艺参数为:pH7.5、酶解温度50 ℃、加酶量2000 U/g、底物浓度4.0%,此条件下胰蛋白酶平均水解度为22.37%±0.46%。对西兰花茎叶蛋白肽的降血脂活性进行研究发现,西兰花茎叶蛋白肽的低、中、高剂量组均有助于改善高血脂症小鼠的血脂水平,且呈现剂量性依赖,并有助于降低高脂膳食小鼠的AI指数和血液 AST和ALT含量,表现出预防动脉粥样硬化和脂肪肝活性,为西兰花茎叶蛋白肽降血脂功能食品开发提供研究基础。