胡椒油中萜类化合物对单增李斯特菌抑菌机理及在冷鲜肉中的应用

李兆亭,陈文学,韩迎洁,孙志昶

(海南大学食品学院,海南海口 570228)

单核细胞增生李斯特菌(L.monocytogenes),简称单增李斯特菌,在自然界中广泛存在,是一种常见的食源性病原体。它具有很强的生存能力,可以在低温、酸性和高盐环境中继续生长。对于低温肉类产品,特别是依赖冷链和严格卫生条件的冷鲜肉以及熟肉制品,如果不进行二次灭菌延长保质期,很容易造成安全隐患[1]。

食品保鲜剂按来源可以分为化学合成保鲜剂和天然保鲜剂,目前市场上以化学抑菌剂为主,化学保鲜剂虽然能起到良好的保鲜效果,但一些化学保鲜剂本身存在着致畸致癌性,长期使用会对人体造成危害[2]。天然保鲜剂具有安全、无毒、广谱抑菌等优点,在肉制品工业中具有广阔的应用前景[3]。此外,随着人们对健康的关注,消费者对食品安全的要求不断提高,寻找能替代化学保鲜剂的天然保鲜剂已成为当今研究的热点[4-5]。

胡椒属于药食同源的植物材料之一,胡椒中挥发油的含量达4.5%以上,胡椒挥发油对鼠伤沙门氏菌、葡萄球菌和大肠杆菌均有抑制作用[6-7]。胡椒油主要成分为萜类化合物,占胡椒油的78.92%,具有抗病毒、细菌、真菌,抗肿瘤,预防心血管疾病以及松弛平滑肌等多种生物活性[8-9]。目前,大多数研究仅讨论天然保鲜剂的宏观抑菌性能,而关于胡椒中萜类化合物对单增李斯特菌的抑菌机理以及在冷鲜肉中的应用鲜有报道。因此,本研究将胡椒油中萜类化合物作为保鲜剂,探究其对单增李斯特菌的抑菌机理以及冷鲜肉的保鲜效果。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

胡椒粉 海南省海口市南国超市;冷鲜猪肉 罗牛山股份有限公司;单增李斯特菌(ATCC19115) 广东环凯微生物科技有限公司;胰酪胨大豆肉汤培养基(TSB) 广东环凯微生物科技有限公司;琼脂 北京Solarbio科技有限公司;磷酸二氢钠 山东西亚化学股份有限公司;磷酸氢二钠、无水硫酸钠 西陇科学股份有限公司;改良牛津培养基(MOX) 上海谷研实业有限公司。

TP-313电子天平 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;ZB125切碎机 诸城华杰机械有限公司;RE52CS旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂;DKZ电热恒温震荡水槽 上海一恒科技有限公司;FD-1A-50真空冷冻干燥机 北京博医康实验仪器有限公司;S3000扫描电子显微镜 日本Hitachi公司;7890B-7000B气相色谱-质谱联用仪(GC-MS) 美国安捷伦科技有限公司;UV752N紫外可见分光光度计 上海佑科仪器仪表有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 胡椒油中萜类化合物的提取 参考王延辉等[10]、邹兰等[11]的方法采用蒸馏萃取(SDE)法提取胡椒中的萜类化合物。SDE条件:取50 g胡椒粉末置于500 mL的圆底烧瓶中,加入200 mL超纯水和少量玻璃珠。接收端装90 mL沸程90～120 ℃石油醚,85 ℃恒温水浴提取60 min。萃取后上层有机相过50 g无水硫酸钠柱,滤液经旋转蒸发仪浓缩后制得萜类化合物粗提物。

1.2.2 萜类化合物化学成分的测定 取0.1 mL胡椒油用正己烷定容至5 mL,取1.5 mL至进样瓶。参考Cui等[12]的方法,色谱柱:HP-5弹性石英毛细管(30 m×0.25 mm,0.33 μm);柱温:60～200 ℃(5 ℃/min);汽化室温度230 ℃;溶剂延迟4 min;传输线温度230 ℃;进样量0.2 μL;载气(He)流量2 mL/min;分流比40∶1。LS质谱条件EI离子源;离子源温度230 ℃;电离能量70 eV;发射电流34.6 μA;电子倍增器电压120 V;质量范围:20～500 amu。使用气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)测定和分析胡椒油中的化学成分。

1.2.3 单增李斯特菌的活化 单增李斯特菌冻干粉和脑心浸液混匀后,取5 μL接种到含有5 mL灭菌TSB肉汤培养基的试管中。参考金源[13]的方法,将试管包裹后37 ℃恒温振荡(80 r/min)培养16 h。在TSB肉汤培养基中传代三次后,通过平板划线纯化菌株。将菌落接种在琼脂平板上,然后将平板置于37 ℃培养箱中16～24 h,挑取单个菌落并在无菌条件下接种到含有TSB肉汤培养基的试管中,再次培养过夜制得菌悬液,4 ℃存储备用。

1.2.4 最低抑菌浓度(MIC)的测定 参考刘雪等[14]的方法将胡椒油加入含有TSB肉汤培养基的试管中,分别得到0.00625%、0.0125%、0.025%、0.05%、0.1%和0.2%(V/V)的浓度。随后,取0.2 mL活化后的菌液于平板上涂布均匀。以无菌水作为空白对照,将各平板于37 ℃中倒置培养24 h,以完全不长菌的最小浓度确定为胡椒油对单增李斯特菌作用的MIC。

1.2.5 细胞裂解程度的测定 将活化后的单增李斯特菌在TSB中培养,在37 ℃温育24 h。将悬浮液在4 ℃条件下4000 r/min离心15 min并收集沉淀。将沉淀物用无菌磷酸盐缓冲溶液(PBS)洗涤三次并重悬浮以制备108CFU/mL(600 nm波长处的吸光值为0.1)的细菌悬浮液。根据1.2.4得出的MIC分别添加萜类化合物,使其浓度分别为0%、0.05%、0.10%、0.15%和0.20%,振荡(150 r/min,37 ℃)培养20 h。将悬浮液在4 ℃下以4000 r/min离心15 min,并通过微孔膜滤器过滤上清液,通过紫外分光光度计在260 nm处测定滤液的吸光度[15-16]。

1.2.6 萜类化合物抑菌的最优浓度 实验组用无菌PBS将胡椒油稀释到试管中,分别得到浓度为0.05%、0.10%、0.15%和0.20%的萜类化合物,对照组用等量蒸馏水代替萜类化合物。随后,参考Nakayama等[17]的研究方法,取1.2.5中菌液(108CFU/mL),用无菌盐水稀释至103CFU/mL,取1 mL接种在琼脂培养基中,并在150 r/min和37 ℃下培养。通过平板计数的方法,分别在培养的0、1、2、4、8、16 h计数活细菌的数目。

1.2.7 扫描电子显微镜(SEM)观测 参考Diao等[18]的方法,通过SEM观察单增李斯特菌形态。取活化后的单增李斯特菌菌液0.1 mL接种于200 mL TSB液体培养基中,根据1.2.5和1.2.5中得出萜类化合物抑菌的最优浓度,在实验组加入0.2 mL胡椒油并在摇床上振荡培养(37 ℃、150 r/min、24 h),对照组不添加胡椒油。取培养12和24 h的菌悬液,6000 r/min离心10 min收集菌体。先后用0.1 mol/L PBS、20%、40%、60%、80%的乙醇和无水乙醇进行洗脱。脱水后的样品在-20 ℃条件下预冻12 h后冷冻干燥12 h,SEM观察其细胞形态。

表1 胡椒油中主要萜类化合物的化学组成Table 1 Chemical composition of major terpenoids in pepper oil

表2 胡椒油中萜类化合物最小抑菌浓度的测定Table 2 Determination of minimum inhibitory concentration of terpenoids in pepper oil

注:-代表无菌落;+代表少量菌落;++代表较多菌落;+++代表大量菌落。

1.2.8 菌液电导率的测定 参考张新虎等[19]的方法,取活化后的单增李斯特菌用无菌PSB(pH=7.4)洗涤3次,根据1.2.5和1.2.6中得出萜类化合物抑菌的最优浓度,取菌液与0.1%胡椒油溶液混合作为试验组(EG),对照组(CG)不添加胡椒油,每隔2 h测定1次电导率,连续12 h。

1.2.9 胡椒油中萜类化合物对冷鲜肉中的保鲜作用 取60 g冷鲜肉,加入140 mL 生理盐水,用均质机制成匀浆,煮沸2 min后过滤,每10 mL滤液分装于试管中,121 ℃ 15 min高温灭菌后各加入10 μL菌悬液。随后,根据1.2.5和1.2.6中得出萜类化合物抑菌的最优浓度,实验组(EG)添加10 μL胡椒萜类化合物,对照组(CG)加入10 μL蒸馏水。将样品在4 ℃条件下存储24 h,每隔6 h取100 μL溶液至MOX选择性培养基,37 ℃培养48 h以计数单增李斯特菌。

1.3 数据处理

每组试验做3次重复实验。方差分析:SPSS 19.0软件对数据进行t检验;图形制作:Origin 8.0。

2 结果与分析

2.1 胡椒油化学成分分析

胡椒挥发油的提取方法有冷压榨法、有机溶剂浸取法、水蒸气蒸馏法、索氏提取法、超声波法、超临界CO2萃取等[20-22]。蒸馏-萃取法是近些年来发展起来的挥发性成分分离方法,具有设备简单、操作容易、溶剂用量小、挥发油的回收率较高等优点。本研究采用蒸馏萃取的方法提取黑胡椒中的挥发油,鉴定出14个化合物,其中萜类化合物12种,占总检出量的77.60%，主要萜类化合物组成及比例见表1。其中柠檬烯主要存在于橘皮精油中的单环单萜烯，常温下是一种无色至淡黄色油状液体,具有特异的柠檬样香气,不溶于水,易溶于乙醇等有机溶剂。

2.2 胡椒油中萜类化合物对L. Monocytogenes的MIC

表2可知,胡椒油中萜类化合物对单增李斯特菌具有较强抑菌作用,MIC为0.05%,随着萜类化合物浓度的提高,其抑菌能力增强。细菌经萜类化合物作用后外膜分解,细胞壁大幅度增厚或分解,表面的粗糙度增加,细胞质减少。柠檬烯可透过线粒体膜,使菌体的细胞器和相同离子渗出过程中的渗透率更大[23]。有关研究指出柠檬烯对金黄色葡萄球菌的MIC为0.05%,10 mL/L的柠檬烯可显著抑制铜绿假单胞菌生长[14,24]。

2.3 胡椒中萜类化合物对单增李斯特菌细胞裂解程度的影响

用萜类化合物处理细菌后,测量其在260 nm处的吸光度作为细菌裂解的指标[25]。如图1所示,随着萜类化合物浓度的增加,单增李斯特菌的吸光度增加,即细菌裂解程度增加。0.10%萜类化合物处理后的吸光度显著高于对照组和0.05%萜类化合物处理组(P<0.05),而与0.15%和0.25%萜类化合物处理后吸光度没有显著差异,这说明萜类化合物对单增李斯特菌的最优抑菌浓度为0.10%,可使得维持细菌生命所需的细胞内成分流失,最终导致菌体死亡。

图1 胡椒油中萜类化合物处理后L. monocytogenes菌悬液吸光度的变化Fig.1 Changes in absorbance of L. monocytogenes suspension after treatment with terpenoids in pepper oil注:图中不同字母表示差异显著(P<0.05)。

2.4 胡椒油中萜类化合物的抗菌活性

加入不同浓度萜类化合物后0～16 h内单增李斯特菌的生长曲线如图2所示,萜类化合物对单增李斯特菌具有良好的抗菌活性。从图2中可以看出,对照组中单增李斯特菌的菌落数不断增加,实验组单增李斯特菌的菌落数先增加后减少。在处理4 h后,0.1%、0.15%和0.2%之间的菌落数无显著差异,但均显著低于0.05%的菌落数(P<0.05)。

图2 胡椒油中萜类化合物对L. monocytogenes的抗菌活性Fig.2 Antibacterial activity of terpenoids in pepper oil against L. monocytogenes

2.5 扫描电镜下单增李斯特菌的形态

由SEM的结果可以清楚地看到单增李斯特菌在萜类化合物作用前后结构的变化(图3)。SEM显示不与萜类化合物相互作用的细菌细胞结构是完整的。萜类化合物处理12 h后,单增李斯特菌之间相互黏连,24 h后细菌大面积溶解,基本无法看到完整的细胞结构。这可能是由于柠檬烯的亲脂活性,结合细胞膜上的磷脂从而使细胞膜结构发生改变[26]。有关报告指出植物精油能够破坏微生物DNA的结构,进而抑制基因表达,影响微生物的正常生命活动及繁殖[27]。但目前植物精油对微生物DNA的影响还处于初步研究阶段,具体的作用位点和作用方式还不明确,有待进一步的研究[28]。

图3 扫描电镜下单增李斯特菌的形态Fig.3 L. monocytogenes morphology under scanning electron microscope注:A、B分别表示12和24 h对照组细菌形态,C、D分别表示12和24 h实验组细菌形态。

2.6 萜类化合物对单增李斯特菌电导率的影响

在细菌受到强抑菌物质的作用时,菌体的细胞膜遭到破坏,失去原有保护能力,细胞内有带电离子等溶出,内部电解质向外泄露到培养液中,导致培养液的电导率增加。因此,细菌细胞膜通透性的变化可以通过菌液电导率值的变化来反映[29]。由图4可知,随着时间的增加,实验组和对照组单增李斯特菌菌液的电导率均增加。这意味着细胞膜的渗透性增加,导致细胞内成分的渗漏,特别是电解质的损失。在6～12 h,添加0.1%萜类化合物菌液电导率显著高于对照组(P>0.05),原因可能是0.1%的萜类化合物对细胞膜的破坏使电解质大量外渗。王亚丽等[30]的研究显示,蓝莓叶多酚也能够增加单增李斯特菌细胞膜的通透性。王帆等[31]指出,茶树精油会导致单核细胞增生李斯特菌的穿孔膜损伤,并大大改变膜的渗透性。

图4 胡椒油中萜类化合物对单增李斯特菌电导率的影响Fig.4 Effect of terpenoids in pepper oil on the conductivity of L. monocytogenes

2.7 胡椒油中萜类化合物对冷鲜肉的保鲜作用

冷鲜肉在分割和贮存过程中很容易被致病菌污染。0.10%萜类化合物对冷鲜猪肉的抗菌活性如图5所示。结果表明,萜类化合物对冷鲜肉中的单增李斯特菌抑制作用明显,与对照组相比,加入萜类化合物后冷鲜肉中的单增李斯特菌生长缓慢。此外,对照组的菌落数在冷藏12 h后已超过冷鲜肉国家标准(菌落总数大于6.0 lg CFU/g为变质肉),但在加入0.10%萜类化合物后24 h仍然处于较低水平。

图5 胡椒油中萜类化合物对冷鲜肉菌落总数的影响Fig.5 Effect of terpenoids in pepper oil on the total colony number of fresh meat

3 结论

本研究探讨了胡椒油中萜类化合物对单增李斯特菌抑菌活性的影响,发现胡椒挥发油中含有12种萜类化合物，其MIC为0.05%，0.1%萜类化合物对单增李斯特菌显示出非常好的抑菌活性。萜类化合物使得单增李斯特菌的细胞膜通透性增加,细胞内容物大量外溢,细胞破碎溶解。萜类化合物在冷鲜肉中抑菌效果明显，加入0.1%萜类化合物后菌落数在冷藏后24 h仍然处于较低水平。胡椒作为一种天然安全植物的香料,在制备保鲜剂方面具有广阔的应用前景。