药用黄芪基因组大小的研究❋

樊慧杰，柴 智，黄浩楹，殷福栋，陈乐乐，赵建平，周 然

(山西中医药大学，山西 晋中 030619)

基因组大小(又称C值)是指生物体单倍体基因组所含的DNA总量，每种生物的基因组总量是恒定的，其大小可用核苷酸碱基对的数量(Mb)来表示。基因组大小被认为是决定生物体生命特征的一个基本生物学属性。研究发现，物种的基因组大小与生物形状和环境因素具有一定的相关性[1-6]。由于许多生物体基因组大小数据空白，这种相关性现象发生的原因目前还不十分明确,所以需要深入研究各物种的基因组大小。

黄芪入药始载于《神农本草经》，可谓历史悠久。2015年版《中国药典》规定药用黄芪为豆科植物蒙古黄芪Astragalusmembranaceus(Fisch.) Bge. var. mongolicus (Bge.) Hsiao或膜荚黄芪Astragalusmembranaceus(Fisch.) Bge.的干燥根[7]。黄芪也是国家卫生部公布的药食同源、可用于保健食品的中草药。现代药理研究发现，黄芪可以提高机体免疫功能[8]，对心脏[9]、神经系统[10]、肾脏[11]、胃[12]等均有保护作用，并具有一定的抗肿瘤作用[13]。但目前对黄芪的研究多集中在药效及其化学成分等方面，而对其基因组还不甚了解。因此，有必要测定黄芪基因组的大小，可进一步揭示蒙古黄芪和膜荚黄芪在基因组大小方面的区别，同时也为黄芪后续的基因组学、种质资源研究提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

蒙古黄芪、膜荚黄芪均来源于山西中医药大学校园内种植基地，摘取新鲜叶子作为蒙古黄芪、膜荚黄芪的实验材料。大豆William 82(由中国科学院东北地理与农业生态研究所孔凡江教授所惠赠)是流式细胞术测定黄芪基因组大小所用的标准植株，在实验室种植大豆William 82，摘取新鲜叶子作为大豆William 82的实验材料。

1.2 实验仪器

BD FACSCalibur流式细胞仪(BD Bioscience Corporation)，PHSJ-4 A实验室PH计(上海仪电科学仪器股份有限公司)，电子天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司)，磁力搅拌器(北京大龙兴创实验仪器有限公司)，HPX-9162MBE电热恒温培养箱(上海博讯实业有限公司医疗设备厂)。

1.3 实验试剂与耗材

碘化丙锭(北京索莱宝科技有限公司，批号326C0428)；RNase(北京索莱宝科技有限公司, 批号20170607)； 400目尼龙筛网(北京索莱宝科技有限公司, 批号20161111)；Tris(北京索莱宝科技有限公司, 批号0922S0714)；Triton X-100(BBI Life Sciences，批号D220BA0041)；Na2EDTA(BBI Life Sciences，批号D328BA0007)；四盐酸精胺(BBI Life Sciences，批号D512BA0029)；β-巯基乙醇(Sigma-Aldrich，批号D124BA0001)；NaCl(生工生物工程股份有限公司，批号D710BA0034)；KCl(生工生物工程股份有限公司，批号D316BA0025)。

1.4 流式细胞术测定蒙古黄芪基因组大小方法的建立

1.4.1 细胞核制备 分别取20 mg蒙古黄芪叶片、膜荚黄芪叶片、大豆William 82叶片、蒙古黄芪和大豆William 82叶片质量比为1∶1混合的样品，膜荚黄芪和大豆William 82叶片质量比为1∶1混合的样品，蒸馏水清洗叶片，滤纸擦干，放入培养皿中。加入1 ml体积的LB01(15 mmol/L Tris, 2 mmol/L Na2EDTA, 0.5 mmol/L四盐酸精胺，80 mmol/L KCl, 20 mmol/L NaCl, 体积分数0.1% Triton X-100，15 mmol/L β-巯基乙醇，调pH值为7.5)，用锋利单刃刀片将叶片快速切碎，冰上孵育5 min，用预先浸润在无水乙醇中的400目尼龙网过滤获得细胞核悬液[14]。先进行3次平行实验。

1.4.2 DNA染色 取过滤后的细胞核悬液，加入1 mg/L RNase 20 μL和1mg/L碘化丙锭(propidium iodide，PI)20 μL轻轻摇匀，4 ℃避光染色，5 min后上机检测。

1.4.3 流式细胞仪检测 上机前各样品振荡5 s，用488 nm的蓝光激发，检测FL2范围内PI发射的荧光强度，低速收集样品细胞核5000个，数据采用流式细胞仪自带专用软件分析。变异系数CV≥5%，表明结果不准确；CV <5%，表明结果基本可信[15]。记录各样品的荧光强度均值，代入公式分析黄芪的基因组大小。基因组大小的计算公式为：黄芪的基因组大小=黄芪峰的荧光强度均值/ William 82峰的荧光强度均值×William 82的基因组大小[16]。

2 结果与分析

图1～5表1、2显示，对大豆William 82、蒙古黄芪和膜荚黄芪分别进行单独的流式细胞仪检测，对比分析单独测定峰，可见峰形明显，峰位的通道数值不同，说明可以用大豆William 82作为蒙古黄芪、膜荚黄芪C值检测的内标植株。流式细胞仪分析蒙古黄芪与大豆William 82混合样品，样品混合后的区分度良好，CV均在5%以内，可以保证计算蒙古黄芪C值结果的可行性和准确性。数据结果显示，蒙古黄芪荧光强度均值是大豆William 82荧光强度均值的1.32倍，而大豆William 82的C值为1.11Gb[17]，由此计算出蒙古黄芪C值为1.46Gb。流式细胞仪分析膜荚黄芪与大豆William 82混合样品，CV均在5%以内，膜荚黄芪荧光强度均值是大豆William 82荧光强度均值的1.37倍，进而计算出膜荚黄芪C值为1.52Gb，由此表明膜荚黄芪的C值大于蒙古黄芪的C值。

图1 大豆William 82样品的流式细胞仪检测结果

图2 蒙古黄芪的流式细胞仪检测结果

图3 膜荚黄芪的流式细胞仪检测结果比较

注：M1：内标大豆William 82的峰位；M2：蒙古黄芪的峰位图4 蒙古黄芪和大豆William 82混合样品流式细胞仪检测结果比较

注：M1：内标大豆William 82的峰位；M2：膜荚黄芪的峰位图5 膜荚黄芪和大豆William 82混合样品流式细胞仪检测结果比较

3 讨论

蒙古黄芪和膜荚黄芪同为现代《中国药典》中收录的药材。但从南北朝《名医别录》开始，入药黄芪的道地产地和种类均随朝代的变迁而变化，黄芪的产地由最初的四川蜀郡、白水，陕西汉中及甘肃陇西，到唐代逐渐转移至甘肃原州和宁夏华州，到宋代以后移至山西，黄芪的种类是在最初的南北朝记载中以膜荚黄芪为主，也逐步过渡到宋代以后的以蒙古黄芪为主[18]。对于蒙古黄芪和膜荚黄芪分类学地位，主要的学术观点有：包括肖培根院士[19]在内的不少学者主张蒙古黄芪是膜荚黄芪的变种，朱相云[20]认为蒙古黄芪是膜荚黄芪的亚种，另有学者认定蒙古黄芪应为独立的一个种[21]。其中，经典主流的学术观点是蒙古黄芪是膜荚黄芪的变种。肖培根[19]通过考证黄芪的变迁历史以及区分子房和小叶的形态，首先提出蒙古黄芪是膜荚黄芪变种的学术观点；钱丹等[22]依据叶绿体单倍型绘制的网状进化树发现，蒙古黄芪的单倍型是由膜荚黄芪单倍型衍射而来，支持膜荚黄芪是较早的原始类群、蒙古黄芪是逐渐分化出来的变种的观点；乔永刚等[23]通过研究膜荚黄芪和蒙古黄芪的核型，发现膜荚黄芪染色体核型为2B型，蒙古黄芪染色体核型为2C型，依据Stebbins的核型进化理论分析，蒙古黄芪比膜荚黄芪更加进化，从核型角度同样支持蒙古黄芪是膜荚黄芪变种进化的结果。

流式细胞术是一种对液流中排成单列的微小颗粒逐个进行快速计数和分选的技术。流式细胞术具有操作简便、结果相对准确的特点，目前越来越被广泛应用于基因组大小的测定领域中。流式细胞术利用特定的荧光染料(PI、EB、AO等)与细胞核的DNA 碱基结合，被荧光染料染色的细胞核在激发光照射下发射出荧光，荧光强度与基因组大小成正比，进而可计算出基因组大小。本研究发现，膜荚黄芪的C值大于蒙古黄芪的C值，从基因组的角度进一步提示蒙古黄芪和膜荚黄芪在生物学上的差异。对于C值大小与物种进化的关系，起初认为进化程度越高C值应该越大，但是随着研究的深入，逐渐发现普遍存在C值的大小与物种的进化程度之间没有严格的对应关系，即“C值悖论”[24]。如非洲肺鱼的C值是人类C值的41倍。在进化过程中植物基因组的多倍化和转座子的积累是基因组增大的可能机制，反转座子之间的同源不平等重组和非正规重组是基因组丢失的可能机制。如拟南芥基因组中就包含大量不完整的反转座子序列，其反映了拟南芥DNA的丢失现象[25]。真核生物基因组中的DNA绝大部分是非编码的DNA序列，非编码的DNA序列就是指基因组中不编码蛋白质的DNA序列，这些序列包括转座子、内含子、启动子、增强子、沉默子等区域。C值差异主要是源于非编码DNA序列的差异，这也就解释了基因组大小与进化程度无直接关系的原因[26]。因此，膜荚黄芪的C值大于蒙古黄芪的C值，并不能否认蒙古黄芪是膜荚黄芪的进化变种，源于可能存在“C值悖论”的现象。

表1 蒙古黄芪C值测定结果比较

表2 膜荚黄芪C值测定结果比较