芬戈莫德静电纺丝膜(PLGA/FTY720)联合神经干细胞(NSC)促进脊髓损伤功能恢复

余双奇,孔维健,潘 肃

(吉林大学第二医院 骨科，吉林 长春130041)

脊髓损伤(SCI)可以导致损伤水平以下严重的运动和感觉功能障碍[1,2]。目前关于脊髓损伤尚无有效的治疗方法。芬戈莫德，也被称为FTY720，是一种被批准用于治疗多发性硬化症的免疫调节药物[3]。芬戈莫德在体外对神经干细胞的影响和对脊髓损伤的修复效果已有相关文献对其进行了研究[4-6]。本研究将FTY720与PLGA以1%的质量比进行混合，通过静电纺丝技术制备PLGA/FTY720静电纺丝膜，利用体外实验探究了静电纺丝膜对NSC增殖分化的影响。并通过构建大鼠脊髓损伤模型探究了在动物试验中对脊髓损伤的治疗效果。结果表明，PLGA/FTY720静电纺丝膜能够促进NSC的增殖分化，PLGA/FTY720纺丝膜联合NSC能够促进脊髓损伤的恢复，具有良好的应用前景。

1 材料与方法

1.1 PLGA/FTY720静电纺丝膜的制备

PLGA (Mw=40,000 g/mol)购自长春中诺生物材料有限公司。静电纺丝膜的制备方法如相关文献所述[7]。将PLGA (100 mg)和FTY720 (1 mg,Gilenya,Novartis)溶于六氟异丙醇中，质量比为1%。然后，将混合物放入装有0.4 mm针头的10 ml注射器中。纳米纤维采用电压调节直流电源(DW-P203-1ACFD，天津)，施加电压20 kv，进给速率为1.0 ml/h。收集器和针头之间的距离为10 cm。从接收屏上收集制得的PLGA/FTY720静电纺丝膜。纯PLGA静电纺丝膜以相同的方法制得。

1.2 神经干细胞培养

所有动物实验程序均经吉林大学动物保护与使用机构委员会批准，并符合《实验动物保护与使用指南》。从胚胎期13.5天SD大鼠的大脑皮层中分离出NSC。这些细胞在T25培养瓶(corning，美国)中以50000个细胞/cm2的密度进行分离和纯化，并在37℃含有5% CO2的环境中培养。生长培养基中含有NB(Gibco,美国)、2% B27(Gibco,美国)、20 ng/mL表皮生长因子(Invitrogen，美国)、20 ng/mL碱性成纤维细胞生长因子(Sigma，美国)和100 ng/mL青霉素-链霉素双抗(Gibco，美国)。培养的原代NSC每4天进行传代，培养基每2天更换一次。传代次数在第2-5代的NSC被用于后续的实验研究。

1.3 细胞增殖与分化检测

NSC以30 000/cm3的密度分别放置在纯PLGA和PLGA/FTY720静电纺丝膜上进行培养，以观察不同静电纺丝膜对NSC增殖的影响。在培养第1,3,7天利用MTT法对NSC增殖的情况进行评估。每孔中加入50 μl MTT溶液，37℃下孵育4 h。离心后吸去上清液，向每孔中加入100 μl DMSO溶液，振荡10 min后在酶联免疫检测仪上选择540 nm波长测量各孔光吸收值。利用RT-PCR技术对NSC在不同静电纺丝膜上的分化情况进行检测。NSC在不同的静电纺丝膜上培养7天后，利用TRIzol试剂盒和PrimeScriptTM试剂盒对细胞中的RNA进行分离和纯化， Tuj-1、GFAP和Oligo分别代表神经元，星形胶质细胞和少突胶质细胞。甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)作为内参基因用于结果校正。各基因引物序列为Tuj-1:GATCGGAGCCAAGTTCTG， GFAP:GCAGACCTTCTC-CAACCTG， Oligo:CGACGCCAAAGAGGAACA-G， GADPH:TCGCCAGCCGAGCCA。

1.4 大鼠脊髓损伤模型构建

成年雌性SD大鼠(200-250 g)购于吉林大学动物中心，随机分为PLGA组(n=5)、PLGA/FTY720组(n=5)、PLGA-FTY720/NSC组(n=5)和对照组(n=5)。所有动物均气管插管，手术过程中均维持吸入异戊烷麻醉。去除背部毛发后腹部向下固定在手术台上，确定大鼠T9体表位置，皮肤消毒后沿背部中线切开，钝性分离肌肉完全暴露椎管结构。咬骨钳咬除棘突和椎板，暴露脊髓。利用眼科剪横断脊髓，充分止血后将大小为5 mm×3 mm的不同的静电纺丝膜覆盖在损伤部位表面，对照组只进行脊髓横断而不植入静电纺丝膜。依次缝合肌层及皮肤，术后连续3天给予抗生素预防感染。

1.5 脊髓功能恢复评估

利用BBB运动评定量表评价大鼠后肢功能恢复情况。实验中的大鼠在损伤后第1,2,3,4周分别进行BBB评分。采用肌电图法检测大鼠的运动诱发电位，评价肌肉反应。大鼠麻醉后将刺激电极置于坐骨神经上激发运动电位，将记录电极置入腓肠肌，记录诱发运动电位的响应情况。

1.6 统计分析

所有定量数据均采用GraphPad Prism 5.0软件进行分析，以均数±标准差表示。采用单因素方差分析(ANOVA)和t检验对两个以上变量进行比较。P<0.05被认为具有显著性差异。

2 结果

本研究采用MTT法测定了NSC在不同静电纺丝膜上第1、3、7天的增殖情况。如图1所示，在第1天时，NSC在纯PLGA静电纺丝膜和PLGA/FTY720静电纺丝膜上在增殖情况无明显差异。第3天时在PLGA/FTY720静电纺丝膜上生长的NSC与PLGA组相比具有更高的OD值，第7天时两组间OD值具有明显的统计学差异，PLGA/FTY720组OD值明显高于PLGA组。利用RT-PCR来评估NSC在不同静电纺丝膜上的分化情况，RT-PCR结果如表1所示。PLGA和PLGA/FTY720两组间Tuj mRNA表达水平无明显差异。PLGA/FTY720组Oligo mRNA表达水平明显高于PLGA组，而GFAP mRNA表达水平则明显低于PLGA组(P< 0.05)。

表1 神经干细胞分化RT-PCR(*，P<0.05,n=3)

为了评价静电纺丝膜联合FTY720和NSC在体内治疗脊髓损伤的效果，本研究建立了T9大鼠模型。利用BBB评分连续4周评估脊髓损伤后功能恢复的情况，评分结果如图2所示。结果显示，损伤后所有组的大鼠BBB评分均降至0分，并随着术后恢复时间的延长逐渐增加，各组BBB评分均在损伤后第4周达到最大。损伤对照组与PLGA组相比较BBB评分无明显差异，两组的BBB评分均低于PLGA/FTY720组和PLGA-FTY720/NSC组。PLGA-FTY720/NSC组的BBB评分在四组中最高。PLGA/FTY720组BBB评分低于PLGA-FTY720/NSC组，但高于PLGA组和损伤对照组。

肌电图的测量结果如图3所示。潜伏期(latency)和波幅(amplitude)两项指标用来评估脊髓损伤后运动功能的恢复情况。结果显示，损伤对照组和PLGA组的潜伏期两组之间无明显差异，但与PLGA/FTY720组和PLGA-FTY720/NSC组相比有明显延长。PLGA-FTY720/NSC组的运动电位潜伏期略短于PLGA/FTY720组，但两组之间无统计学差异(P>0.05)。在四组中PLGA-FTY720/NSC组波幅数值最大，明显高于另外三组。PLGA/FTY720组的波幅高于PLGA组和损伤对照组，但与PLGA-FTY720/NSC组相比仍有一定差距。PLGA组与损伤对照组波幅数值最小，且两组间无统计学差异。

图1 神经干细胞细胞增殖(*，P<0.05,n=3)

图2 BBB评分(*，P<0.05,n=3)

图3 肌电图测量结果(*，P<0.05,n=3)

3 讨论

脊髓损伤后神经功能的恢复一直是治疗脊髓损伤的关键问题[1,2]。损伤产生的不连续脊髓断端大大降低了神经修复的速度和效果。生物材料为结构性损伤中神经细胞的生长和迁移提供了结构基础，对损伤后神经功能的恢复和恢复具有积极的影响[7,8]。然而，由于脊髓损伤后局部炎症微环境等不良因素对NSC向神经元分化有抑制作用，因此仅应用生物材料并不能达到较好的治疗效果[9,10]。此外，内源性NSC数量有限，不足以分化为足够数量的神经元。因此，将药物与生物材料和NSC联合应用于脊髓损伤的治疗具有良好的研究前景和治疗效果。FTY720对中枢神经系统有明显的保护作用[11]。FTY720一般通过静脉给药或口服给药来发挥作用，但有研究表明，全身应用FTY720会引起粒细胞缺乏症等不良反应[12，13]。

本研究应用静电纺丝技术制备了载有FTY720的静电纺丝膜。为了探究 PLGA/FTY720静电纺丝膜对NSC增殖分化的影响，我们将NSC在不同的静电纺丝膜上进行了培养和检测。细胞增殖实验结果表明，在混有FTY720的PLGA静电纺丝膜表面培养的NSC具有更高的OD值，这说明1%FTY720对NSC的增殖有明显促进作用。RT-PCR结果显示，PLGA/FTY720能明显抑制NSC向星形胶质细胞的分化，促进神经元和少突胶质细胞的形成。在脊髓损伤的功能重建过程中，神经元可以进一步分化为功能神经元，在信号传递中发挥作用，少突胶质细胞可以促进髓鞘和轴突的再生，在功能恢复中发挥积极作用[14,15]。虽然RT-PCR结果未显示PLGA/FTY720对NSC向神经元分化有明显影响，但PLGA/FTY720可促进NSC向少突胶质细胞分化，分化形成的少突胶质细胞可以促进轴突再生。结果还发现，FTY720对星形胶质细胞的分化具有明显的抑制作用，而星形胶质细胞则可导致胶质瘢痕形成，影响脊髓神经功能的恢复与重建[16]。通过RT-PCR所得到的细胞分化结果与有利于脊髓神经功能恢复的分化结果相一致，说明FTY720对脊髓损伤的恢复具有明显的促进作用。

为了更好地评价PLGA/FTY720和PLGA-FTY720/NSC静电纺丝膜的治疗效果，本研究构建建立了T9大鼠脊髓全切模型。通过在损伤部位植入不同种类的静电纺丝膜来探究FTY720和NSC对脊髓损伤修复的效果。BBB评分结果显示，PLGA-FTY720/NSCs能明显促进后肢运动功能恢复。PLGA/FTY720和PLGA单独制成的静电纺丝膜的也能在一定程度上恢复后肢运动功能，但效果不如载有NSC的PLGA/FTY720静电纺丝膜明显。这一结果说明NSC在脊髓损伤功能恢复中具有重要作用，NSC能够明显促进脊髓损伤后的功能恢复。神经冲动在传递过程中，神经元的潜伏期和振幅是评价神经功能的重要指标[17]。肌电图的结果显示，在四组中PLGA-FTY720/NSC组具有最短的潜伏时间和最大的振幅，这说明PLGA-FTY720/NSC组对脊髓损伤修复的促进作用最为明显，这一结果也与BBB评分所得到的结果相一致。动物实验的结果表明，FTY720和NSC均能够促进脊髓损伤功能恢复，两者联合应用时效果更加显著。