黄芩苷对人肺成纤维细胞增殖及FN蛋白的影响

苗永迪，刘文晔，赵 雷，赵书涵，岂 蕊，王隐瑜，郑晨曦，孙 聪

(长春中医药大学，吉林 长春130117)

肺纤维化(PF)是临床上常见的疾病[1,2]。黄芩苷是中药黄芩的活性成分，黄芩苷可抑制成纤维细胞合成相应基质从而介导炎症性疾病的发生。本研究利用不同浓度的黄芩苷干预体外培养的肺成纤维细胞，结合分子生物学技术观察中药单体黄芩苷对人肺成纤维细胞中纤维黏连蛋白(FN)的mRNA及蛋白表达，探讨黄芩苷抑制人肺成纤维细胞增殖的分子机制。

1 材料与方法

1.1 材料和试剂

1.1.1细胞系 HFL1细胞系(人肺成纤维细胞体外培养细胞系)购于中国科学院上海细胞库，置于10%优级胎牛血清Hepes调节的DMEM细胞培养基中培养。

1.1.2主要试剂 黄芩苷纯度为91.7%，编号为XEBJ-6RQ3，购自中国药品检定研究所；醋酸泼尼松片，生产批号为20131114，购自天津天药药业股份有限公司；逆转录试剂盒、FN polyclonal antibody购自杭州博日生物科技。

1.1.3引物 引物由上海生工合成，序列见表1。

表1 PCR引物序列

1.2 方法

1.2.1HFL1细胞培养 将细胞用含有10%胎牛血清的DMEM培养基进行细胞复苏，放置恒温培养箱中传代培养，培养箱参数设置为37℃、5%CO2。每天固定时间观察细胞生长状态，待培养瓶内的细胞长至90%以上时，加2 ml的0.25%胰酶进行消化90 s，计数传代。

1.2.2细胞分组及给药 将混悬后的细胞随机分为5组，即阳性药组、黄芩苷高浓度组、黄芩苷中浓度组、黄芩苷低浓度组、空白组，每组细胞为2×105。精密称取黄芩苷，用DMEM培养基稀释浓度依次为10 mM、5 mM和1 mM，称取醋酸泼尼松片于DMEM培养基中溶解，配成终浓度为1 mM，将细胞混悬液进行离心弃去上清液，加入含有相应药物的培养基。

1.2.3细胞增殖抑制率检测 当培养瓶内的细胞处于对数生长期时加入0.25%胰蛋白酶进行消化，使贴壁的细胞吹打成混悬液，并接种在96孔板中。继续培养细胞至贴壁状态，加入含有黄芩苷的培养基，每组在培养24 h，48 h和72 h后加MTT 20 μl，继续孵育4 h，离心弃掉上清，加入DMSO试剂150 μl，室温振荡20 min。待晶体溶解后测570 nm处的吸光度，每组设5个复孔，记录结果。

1.2.4mRNA检测 选用β-actin为内参，Trizol法进行总RNA提取，RT-PCR扩增步骤根据说明书进行操作。本扩增体系共循环30次，最后保持72℃延伸10 min。0.8%琼脂糖凝胶电泳检测FN的扩增产物，上样顺序为阳性药组、黄芩苷高浓度组、黄芩苷中浓度组、黄芩苷低浓度组、空白组。反应条件如表2。

1.2.5蛋白检测 将混匀后的细胞液离心弃上清，加细胞裂解液提取总蛋白，煮沸使蛋白变性，SDS-PAGE电泳上样量为10 μl，封闭液封闭3 h，一抗(β-actin、FN)4℃孵育过夜，PBST洗膜后二抗孵育1 h，洗膜后DAB显色，利用凝胶成像系统进行灰度值扫描。

表2 PCR反应条件

1.2.6统计学分析 Image J软件对NC膜上的条带灰度分析，利用SPSS19.0软件对数据分析，采用单因素方差分析，比较组间差异。

2 结果

2.1 MTT检测细胞增殖抑制率

空白组细胞生长状态良好，无悬浮细胞且生长速度快、贴壁面积分布广；醋酸泼尼松阳性药组有半数细胞呈悬浮状态，随时间增长悬浮量呈逐渐上升趋势；黄芩苷各浓度组部分细胞悬浮于培养瓶中，高浓度组较多，中浓度组次之，低浓度组较少。各给药组干预细胞72 h，细胞增殖抑制率结果见表3，MTT结果表明黄芩苷对HFL1细胞有较大程度的增殖抑制效果，高浓度组抑制最为明显，与空白组比较有统计学差异(P<0.05)。

表3 MTT测定细胞增殖抑制率

2.2 FN mRNA表达结果

醋酸泼尼松组和黄芩苷各浓度组干预下，FN mRNA表达明显下降，与空白组比较有显著差异(P<0.01)；组间差异比较结果显示，FN mRNA黄芩苷高浓度组与中、低浓度组相比有显著差异(P<0.01)，FN mRNA中浓度组与低浓度组比较有差异(P<0.05)，如图1。

注：与空白组比较△P<0.01，与醋酸泼尼松组比较▲P<0.01

2.3 FN蛋白表达结果

在黄芩苷和醋酸泼尼松干预下，HFL1细胞中FN蛋白表达水平均有下降，FN蛋白黄芩苷高、中浓度组、醋酸泼尼松组相比空白组，有显著统计学差异(P<0.01)，低浓度组与空白组相比无统计学差异(P>0.05)。FN蛋白黄芩苷高、中、低浓度组与醋酸泼尼松组相比，有显著性差异(P<0.01)，FN蛋白高浓度组与中、低浓度组比较均有显著性差异(P<0.01)，中浓度组与低浓度组比较亦有显著性差异(P<0.01)，如图2。

注：与空白组比较△P<0.01,与醋酸泼尼松组比较▲P<0.01

3 讨论

肺纤维化的发生发展过程中，HFL1的增殖受大量细胞因子的调控，在体内细胞因子的正性与负性调控失衡时，引起肺成纤维细胞的大量增殖，进而诱发肺纤维化[3]。FN是广泛存在的非胶原糖蛋白，肺纤维化病变时肺内FN含量明显增高，提示FN早期存在于肺成纤维细胞中，对肺纤维化的形成有一定的影响[4，5]。本实验通过体外培养HFL1细胞，以醋酸泼尼松为阳性药对照组，观察黄芩苷高浓度组10 mM、中浓度组5 mM和低浓度组1 mM干预HFL1的增殖效果，孵育72 h后MTT法检测细胞的增殖抑制率，分子生物学技术检测给药干预后HFL1细胞中FN蛋白及mRNA的表达。结果发现黄芩苷对HFL1细胞抑制效果呈浓度依赖性，高浓度组与阳性药组抑制效果相当，说明黄芩苷可有效的抑制HFL1细胞的增殖；Western-blotting和RT-PCR结果显示，黄芩苷可有效降低FN蛋白及mRNA的表达，且浓度在10 mM、5 mM时效果明显，与空白组比较有显著差异，表明FN在转录及翻译过程中均受抑制，提示黄芩苷的抑制作用在RNA水平已有较好的效果，为后续转录组学的研究提供基础。肺纤维化的发生发展与FN表达量密切相关，本研究证实黄芩苷可有效抑制FN的表达，进而改善肺纤维化的病变，为临床治疗肺纤维化提供理论依据。