血清中MRE11、TPO、Th 17Treg、IL-17、VEGF在儿童再生障碍性贫血免疫发病的诊断价值及治疗意义

褚保凤,底建辉,方 强,常宏宇

(1.北京市大兴区人民医院 儿科，北京102600；2.北京市房山区第一医院 泌尿外科，北京102400;3.中国人民解放军火箭军总医院 儿科,北京100088)

再生障碍性贫血(Aplastic Anemia，AA，再障)是多种原因造成造血机能下降，致中性粒细胞、红细胞、血小板减少的一组综合征[1,2]。再生障碍性贫血在临床上可表现为骨髓造血功能低下、全血细胞减少感染综合征，可发生于各年龄段，多发病于小儿[3]。再生障碍性贫血的具体病因还不明确，当前有研究认为机体的免疫异常和淋巴因子介导的造血干细胞过度凋亡可引起骨髓衰竭，且造血干细胞被大脂肪细胞所取代，纤维网间仅含少许小淋巴细胞，纤维粘附颗粒极少，从而促使骨髓造血发生障碍[4,5]。MRE11(meiotic recombination 11 homologA)是MRN复合物的主要成员之一，定位于11q21，包括N端的4个磷酸酯酶结构域，以及2个DNA结合结构域，可参与同源重组、端粒长度的维持和DNA双链断裂修复[6]；特别是当DNA损伤时，维持遗传信息的稳定性，维持染色体的稳定性[7]。血小板生成素(thrombopoietin，TPO)、白细胞介素(interleukin，IL)-17等可以刺激巨核细胞的生长和血小板的生成，从而影响巨核细胞成熟[8]。调节性T细胞(Treg)在维护机体免疫平衡中发挥了重要作用，Th 17Treg细胞分化主要依赖特异性转录因子及相关细胞因子信号[9]。转录因子RORΥ1是Th17细胞分化的关键转录因子，属于核激素受体超家族成员；叉头状/翅膀状旋转转录因子(Fox head/winged helix transcription factor P3，Foxp3)属于叉头蛋白家族，是Treg细胞最主要的调控因子，其能维持Treg细胞的免疫调节活性与免疫低反应性[10]。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是一种功能性糖蛋白，也是一种促血管生成因子，其具有促进血管内皮细胞分裂增生的能力，并能增强毛细血管的通透性，为多种炎症性疾病的主要生物活性因子[11]。本文具体探讨了血清中MRE11、TPO、Th 17Treg、IL-17、VEGF在儿童再生障碍性贫血免疫发病的诊断价值及治疗意义，希望为揭示儿童再生障碍性贫血发病机制和指导临床诊治提供基础。现总结报道如下。

1 对象与方法

1.1 研究对象

研究得到了医院伦理委员会的批准，采用回顾性研究方法，收集2011年8月到2018年2月在北京市大兴区人民医院诊治的再生障碍性贫血患儿42例作为观察组，同期留取42名儿童保健科体检者外周血作为对照组，纳入标准：观察组患儿都经临床诊断和骨髓病理活检确诊为再生障碍性贫血；对照组患儿排除恶性血液病；年龄1-6岁；临床与检测资料完整；标本的采集事先均征得家长同意。排除标准：临床资料缺乏者；合并先天性心肝肾异常的患儿；合并其他免疫类疾病的患儿；患有对贫血产生影响的其他疾病的患儿。

观察组中男22例，女20例；平均年龄4.53±1.11岁；平均体重18.20±2.48 kg；平均身高109.28±10.48 cm；平均病程19.28±2.11个月；初治32例，复治10例；平均血小板计数为(16.28±10.88)×109/L；平均巨核细胞数1.89±0.49个。

对照组中男21例，女21例；平均年龄4.78±1.09岁；平均体重18.21±3.72 kg；平均身高108.92±9.78 cm；平均血小板计数为(186.22±41.87)×109/L；平均巨核细胞数0个。

1.2 MRE11、TPO、IL-17、VEGF检测

空腹抽取两组小儿的外周静脉血1-2 ml，常规抗凝后低温3 500 r/min离心20 min(离心半径10 cm)，留取血浆冻存于-80℃冰箱。采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验定量检测法检测MRE11、TPO浓度，试剂盒购自苏州卡尔文生物有限公司；采用双抗体两步夹心酶联免疫吸附法检测IL-17、VEGF含量，试剂盒购自苏州卡尔文生物有限公司。

1.3 Th 17Treg检测

取1.2中的血液样本，分离收集外周血单核细胞，抽提RNA，采用qRT-PCR法检测Th 17Treg RORΥ1、Foxp3表达水平，RORΥ1正向引物5′-GCGTGTGAACCAGTGGTAGATC-3′，反向引物5′-AGGAAGTCCATGTGGGAGATGT-3′；Foxp3正向引物5′-CAGCACATTCCCAGAGTTCCTC-3′，反向引物5′-CCCACCACCTCACCGAGGCCA-3′。在PCR中，95℃预变性10 min，95℃变性15 s，60℃退火并延伸1 min，共进行45个循环。

1.4 统计方法

SPSS22.00统计软件进行数据分析，计量与计数数据采用均数±标准差和百分率表示，对比为t检验与卡方(χ2)分析，两变量相关性分析采用Pearson直线相关，所有P值均为双侧检验，检验水准为ɑ=0.05。

2 结果

2.1 MRE11、TPO、IL-17、VEGF含量对比

观察组的TPO、IL-17含量高于对照组，MRE11、VEGF含量低于对照组，对比差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 两组MRE11、TPO、IL-17、VEGF含量对比(均数±标准差)

2.2 Th 17Treg表达水平对比

观察组的Th 17Treg细胞中的RORΥ1表达水平高于对照组，Foxp3表达水平低于对照组，对比差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 两组Th 17Treg表达水平对比(×10-3，均数±标准差)

2.3 相关性分析

在观察组患儿中，直线相关性分析显示Th 17Treg细胞中的RORΥ1表达水平与TPO、IL-17、血小板计数、巨核细胞数呈正相关性(P<0.05)，与MRE11、VEGF含量呈负相关性(P<0.05)；Foxp3表达水平水平与TPO、IL-17、血小板计数、巨核细胞数呈负相关性(P<0.05)，与MRE11、VEGF含量呈正相关性(P<0.05)。见表3与图1。

表3 儿童再生障碍性贫血免疫发病Th 17Treg细胞表达水平与临床资料的相关性(n=42)

图1 儿童再生障碍性贫血免疫发病Th 17Treg细胞表达水平与临床资料的相关性

3 讨论

再生障碍性贫血是一种骨髓造血功能严重衰竭的疾病，临床上对患者的识别率低、误诊率高，临床病程差异较大，预后一般比较差，主要与病情的严重程度和全血细胞减少持续时间有关[12]。流行病学调查显示再生障碍性贫血的年发病率约为百万分之七，多发于小儿，其中50%以上的患者于出现症状6个月内死亡[13]。

本研究显示观察组的TPO、IL-17含量高于对照组，MRE11、VEGF含量低于对照组，对比差异有统计学意义。MRE11蛋白定位于11q21，可参与DNA双链断裂修复；人体细胞如果MRE11发生突变，会导致共济失调-毛细血管扩张样疾病，诱发患者出现发育迟缓、癌症易感、小脑退行性变、免疫缺陷等病症[14]；此外MRE11蛋白在细胞周期检验点、维持染色体稳定和DNA复制中都有重要的作用，其与肿瘤的发生和发展密切相关[15]。TPO能够在不同阶段参与调节巨核细胞的分化、血小板的生成，其是巨核细胞系特有的造血生长因子[16]。骨髓是一个非常复杂的器官，骨髓基质又称骨髓微环境，由结缔组织和血管系统组成，VEGF在骨髓组织血管生成、基质细胞增殖分化方面起着重要作用[17]；VEGF是一种具有高度生物活性的功能性糖蛋白，具有维持血管正常状态和完整性、提高血管通透性、促血管生成作用等多种作用；VEGF基因全长共14 kb，由7个内含子和8个外显子构成，可特异地作用于内皮细胞，具有促进新生血管形成的作用[18]。

本研究显示观察组的Th 17Treg细胞中的RORΥ1表达水平高于对照组，Foxp3表达水平低于对照组，对比差异有统计学意义。Th17细胞可产生IL-17，在介导慢性炎症和自身免疫性疾病等过程中发挥重要作用；IL-17也可以有效的促进CD4+细胞分化成为Th17细胞，使嗜中性粒细胞大量聚集而发挥生理作用，进而促进趋化细胞因子和粘附分子的合成和释放，从而对再生障碍性贫血的病理发展产生影响；IL-17也可以诱导其它炎症性细胞因子的表达，介导炎症细胞参与局部炎症反应和组织损伤[19]。Treg细胞具有免疫无能和免疫抑制的功能特性，可增强机体免疫监视功能，可减轻移植排斥反应[20]。在存在活化的树突状细胞及细胞因子IL-6时，Treg细胞可以转化为Th17细胞。RORΥ1属于核激素受体超家族成员，是Th17细胞分化的关键转录因子，并且与IL-17表达高度相关[21]。Foxp3是转录因子Forkhead家族的成员之一，是Treg的特征性调控因子，同样在Treg细胞的增殖、分化过程中起到关键作用[22]。当前有研究表明Th 17Treg可能和Th1型细胞因子一样可以产生直接或间接抑制骨髓造血作用，再生障碍性贫血患者骨髓及外周血Th17细胞增多并同时检出Treg细胞的减少，且对于治疗有效的病例，Th17细胞数目恢复至正常水平[23]。

再生障碍性贫血主要是指骨髓干/祖细胞和造血微环境受到生物、物理、化学等各类因素破坏，使血液中的全血细胞减少的血液系统综合病症。免疫发病机制为再生障碍性贫血的研究热点，T淋巴细胞数量及功能异常与该病的发病密切相关。Treg细胞主要来源于胸腺，在维持机体内环境稳定、肿瘤免疫检测及自身免疫性疾病的发生中发挥重要作用[24]。MRE11作为DNA损伤修复蛋白在人体的DNA损伤修复中起重要作用，当双链DNA断裂发生后，MRE11可以感应断裂的产生，可以使DNA的构象发生改变，可以激活下游的效应分子，从而有利于维持基因组稳定[25]。当前研究表明TPO可以直接抑制STAT3磷酸化，从而能够调节TPO受体池的数量来改善贫血[26]。基础研究显示再生障碍性贫血小鼠的中枢神经系统中可检测到大量产生IL-17的CD4+T细胞浸润，抗IL-17治疗可部分缓解贫血症状。VEGF不仅直接刺激内皮细胞的有丝分裂、游走与增殖，还可诱导毛细血管的生成，增加微血管通透性，促进血浆纤维蛋白外渗。VEGF也可改变细胞外基质，使其有利于血管生成[27]；还可刺激内皮细胞产生一氧化氮，且可使其浓度呈剂量依赖性升高，从而起到血管维持功能。同时Treg细胞数量及其转录因子Foxp3表达显著减少；不过只用Th1细胞功能亢进、Treg细胞减少并不能完全解释再生障碍性贫血发病的病理生理学机制[28]。本研究也有一定的不足，再生障碍性贫血患儿的样本数量不够，且上述各种指标受到外在因素的影响比较大，可能存在一定的研究偏倚，将在下一步进行深入分析。

总之，血清中MRE11、TPO、Th 17Treg、IL-17、VEGF在儿童再生障碍性贫血中呈现高表达情况，可互相影响，共同参与该病的免疫发病。

作者简介：褚保凤(1978-)，女，硕士研究生，主治医师，研究方向：小儿血液系统疾病。