人TSHR A亚单位重组腺相关病毒2/9载体的构建及鉴定

赵凤仪，何明倩，王 悦，张 萌，胡诗倩，施秉银，伍丽萍

(西安交通大学第一附属医院内分泌科，陕西西安 710061)

人促甲状腺素受体(thyrotropin receptor, TSHR)存在于甲状腺细胞膜上，是一种刺激细胞生成甲状腺激素和三碘甲状腺激素的跨膜受体，有研究认为它也是引起格雷夫斯病(Graves’ disease, GD)最重要的自身抗原。TSHR A亚单位(TSHR289)是从TSHR脱落的一段抗原，研究证实真正引发和促进GD免疫反应的是TSHR289这段抗原[1]。通过多次注射表达TSHR289的重组腺病毒制备GD动物模型是目前最经典的方法，在作者实验室诱导新生小鼠对GD免疫耐受的研究中，Ad-TSHR289也是表达目的抗原的一个重要载体[2-3]，然而腺病毒载体介导的目的基因表达时间短，且容易诱发机体的免疫反应，故限制了其反复应用。但腺相关病毒(adeno-associated virus, AAV)具有目的基因表达持久、免疫反应小、无致癌性等优点，成为近年来基因治疗中最为常用的病毒载体之一[4]。目前已经发现的AAV血清型主要有13种，而研究显示9型AAV也是一种对骨骼肌具有非常高的转导效率的较新血清型AAV[5-6]。本研究旨在构建能够表达TSHR289基因的重组腺相关病毒2/9杂合载体，为探索Graves病发病机制及防治研究工作提供更佳方式的可能性。

1 材料与方法

1.1 材料AAV载体质粒pAAV-IRES-ZsGreen、包装质粒pAAV-2/9(AAV2-Rep, AAV9-Cap)、辅助质粒pHelper、JM109感受态细菌、pDC315-TSHR289真核表达质粒、293AAV细胞系、HEK293(由本实验室保存)，EcoRⅠ、BamHⅠ限制性内切酶、T4 DNA连接酶(美国NEB公司)，CPT高效转染试剂盒(武汉维诺赛生物技术有限公司)，小量质粒抽提试剂盒(北京全式金生物技术有限公司)，Qiagen大规模质粒抽提试剂盒 (德国Qiagen公司)，DNA测序(美国Invitrogen公司)，Millex-HV针头式过滤器0.45 μm PVDF膜(美国Millipore公司)，ViraBindTM腺相关纯化试剂盒(美国Cell Biolabs公司)，RT-PCR试剂盒(南京诺唯赞生物科技有限公司)，人TSHR-ELISA试剂盒(美国CUSABIO公司)。

1.2 pAAV-hTSHR289-IRES-ZsGreen载体的构建将质粒pAAV-IRES-ZsGreen和pDC315-hTSHR289用限制性内切酶EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切后，通过T4 DNA连接酶将酶切产物连接，转化JM109感受态细菌，涂布于含Ampicillin抗性的LB平板上过夜培养，在平板上挑取单菌落、继续培养，小量质粒抽提试剂盒抽提质粒，用EcoRⅠ+BamHⅠ做酶切鉴定。鉴定正确后，然后送菌液去测序。

1.3 携带hTSHR289基因的重组腺相关病毒的包装按照每皿1.5×107个293AAV细胞接种到15 cm细胞培养皿中，培养30～48 h，当细胞贴壁后即可开始转染。采用磷酸钙法将载体质粒、包装质粒、辅助质粒按CPT高效转染试剂盒说明书转染目的质粒到细胞。24 h于激发波长510 nm处，荧光显微镜下观察pAAV-hTSHR289-IRES-ZsGreen转染293AAV细胞的变化。转染72 h，于荧光显微镜下计数AAV-293细胞中表达hTSHR289绿色荧光细胞比例，确定病毒包装效率。病毒包装完成后，用吸管反复吹打细胞，使所有细胞从培养皿上完全脱落下来收集到离心管中，-80 ℃和37 ℃反复冻融3次，离心，收集上清，用0.45 μm PVDF滤器过滤去除细胞碎片，ViraBindTM腺相关纯化试剂盒过病毒纯化柱纯化，洗脱，获取腺相关重组病毒。

1.4 rAAV2/9-hTSHR289-IRES-ZsGreen重组腺相关病毒滴度的测定取20 μL浓缩病毒液，加入1 μL RNase-free DNase(2 U/100 μL)，混匀，37 ℃孵育30 min，10 000 r/min离心10 min，取20 μL上清加80 μL稀释Buffer至另一个无菌1.5 mL EP管中，混匀，100 ℃金属浴反应10 min。自然冷却至室温，加入3 μL(约0.2 u)蛋白酶K，37 ℃孵育60 min。100 ℃金属浴反应10 min，冷却至室温。将上述样品稀释后用做模板，采用实时荧光定量PCR(rQ-PCR)检测法测定重组腺相关病毒滴度。通过检测hGH polyA序列表达水平反映病毒滴度，rQ-PCR引物为：hGH-F：5′-TGGGAAGACAACCTGTAGGG-3′，hGH-R：5′-GTGAAACCCCGTCTCTACCA-3′。建立rQ-PCR反应体系，反应条件为：50 ℃ 2 min；95 ℃ 10 min；95 ℃ 30 s和60 ℃ 30 s循环40次。制作标准曲线计算病毒样品滴度。

1.5 rAAV2/9-hTSHR289-IRES-ZsGreen感染HEK293的蛋白表达水平的测定将4×103个HEK293细胞培养于96孔板中，共20个孔，24 h后分别用纯化后的rAAV2/9-hTSHR289-IRES-ZsGreen感染细胞，感染复数=1×105，感染后分别在48、72、96 h用人TSHR ELISA试剂盒检测细胞培养液中hTSHR289蛋白的表达，将细胞培养液以不同浓度稀释，确定最佳稀释度，操作步骤按试剂盒说明书执行。

1.6 统计学分析数据应用SPSS软件(19.0)进行统计学分析。统计结果以均数±标准差表示，数据采用多组间单因素方差分析中两两比较的LSD法，并行方差齐性检验和正态性检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 重组腺相关病毒骨架质粒pAAV-hTSHR289-IRES-ZsGreen的鉴定成功将目的基因hTSHR289插入pAAV-IRES-ZsGreen中IRES序列上游的多克隆位点中(图1A)。对重组质粒pAAV-hTSHR289-IRES-ZsGreen行EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切，凝胶电泳显示产物片断大小与预期大小一致(图1B)，测序结果正确(图2)。

图1 pAAV-hTSHR289-IRES-ZsGreen质粒鉴定

Fig.1 Identification of pAAV-hTSHR289-IRES-ZsGreen plasmid

A：pAAV-hTSHR289-IRES-ZsGreen质粒图谱；B：pAAV-hTSHR289-IRES-ZsGreen质粒双酶切鉴定电泳图。

图2 pAAV-hTSHR289-IRES-ZsGreen双酶切产物测序图

Fig.2 The sequence map of pAAV-hTSHR289-IRES-ZsGreen double digestion products

2.2 重组腺相关病毒包装效率的观察24 h荧光显微镜下观察可见，pAAV-hTSHR289-IRES-ZsGreen已明显转染至293AAV(图3)，rAAV2/9-hTSHR289-IRES-ZsGreen效率观察显示，转染24 h只有极少数荧光细胞出现，随时间延长表达荧光细胞数逐渐增多，荧光也逐渐增强，转染72 h绿色荧光细胞数计数比例可达92%～94%(图4)，提示病毒包装效率达93%左右。

2.3 rAAV2/9-hTSHR289-IRES-ZsGreen病毒滴度的测定结果rQ-PCR法测得 rAAV2/9-hTSHR289-IRES-ZsGreen溶解曲线为单峰，无杂峰；扩增曲线平滑，扩增效率(%)=157.8%；标准曲线线性相关系数R2=0.975 8，线性回归方程为：y=-4.114 1x+15.067，根据标准曲线测得rAAV2/9-hTSHR289-IRES-ZsGreen的滴度为1×1013vg/mL，根据文献[7-8]提示，该浓度达到AAV载体感染细胞及动物实验的有效滴度。

图3 质粒pAAV-hTSHR289-IRES-ZsGreen转染293AAV细胞24 h荧光图(A)和对应的白光图(B)

Fig.3 Fluorescence picture (A) and responding non-fluorescence picture (B) observed by fluorescence microscope for the transfection of 293AAV Cell with plasmid pAAV-hTSHR289-IRES-ZsGreen for 24 h (×10)

图4 1 μL rAAV2/9-hTSHR289-IRES-ZsGreen感染HEK293细胞72 h的不同视野荧光观察结果

Fig.4 Images of HEK293 cells infected with rAAV2/9-hTSHR289-IRES-ZsGreen in different fields of vision (×10)

A、B：2个不同视野下的荧光图；C、D：分别为A与B的对应白光图。

2.4 HEK293细胞经AAV2/9介导的hTSHR289蛋白的水平变化ELISA法结果显示，细胞培养液最佳稀释度为20倍，感染72 h，hTSHR289表达明显高于48 h，而96 h的hTSHR289的表达较72、48 h均显著增高，且有统计学意义(P<0.05，图5)。

3 讨 论

GD是一种以TSHR为自身抗原的器官特异性自身免疫性甲状腺疾病。TSHR引起该病免疫反应的具体机制尚未完全阐明，而目前主要通过建立动物模型研究疾病的发生发展。以多次注射表达TSHR289的重组腺病毒制备的GD小鼠模型在国外已被广泛应用，近年来作者实验室也用作研究发病机制和寻找新防治方法的主要工具[9-13]。然而，由于腺病毒载体应用中存在缺点，如表达时间短需反复注射且机体容易产生针对性中和抗体等，而AAV载体正好克服了这些缺陷，具有无致病性、低免疫原性及宿主范围广等优点，且不含有任何已知人类疾病的相关序列，对人类无致病性，因此，是目前安全性最好的病毒载体之一；腺相关病毒能够感染各种宿主细胞，并能定点整合至宿主细胞基因组中，故而腺相关病毒能携带外源基因进入宿主细胞并长期表达。AAV因其独特的优势正日益成为理想的病毒载体[4,14]，其作为目前基因载体研究的热点，已广泛应用于基因功能研究、构建疾病模型、制备基因敲除小鼠等方面。有研究证实AAV2/8和AAV2/9在肌肉组织均表达效率高，但AAV2/9在BALB/c小鼠肌肉组织表达效率明显强于AAV2/8，而用于GD的研究动物多为BALB/c小鼠[5]。因此，本研究构建rAAV2/9-hTSHR289-IRES-ZsGreen以进一步优化GD动物模型制备以及基因预防的方法。

图5 ELISA法检测HEK293细胞经AAV2/9介导的hTSHR289蛋白的水平变化

Fig.5 hTSHR289 protein expression of HEK293 cell induced by AAV2/9 detected by ELISA

***P<0.001。

本实验采用AAV辅助系统，并选用包含IRES和绿色荧光标记基因ZsGreen的pAAV-IRES-ZsGreen作为其骨架质粒，先将目的基因hTSHR289连接至pAAV-IRES-ZsGreen，经测序和酶切鉴定后证实外源目的基因hTSHR289已成功连接至骨架质粒，然后采用“三质粒共转染法”，成功制备了rAAV2/9-hTSHR289-IRES-ZsGreen的重组腺相关病毒杂合载体，并减少了腺病毒污染。本实验通过镜下荧光计数及ELISA检测和鉴定，提示其转染效率较高，并能成功表达。而载体中的IRES包含载体基因组进行包装、复制整合及病毒基因组环化所需的顺式作用元件[15]，该序列来源于一些病毒及细胞mRNA 5′端的一段非翻译区，能大大提高转移及表达效率，并在上游启动子控制下和与之相连的基因共同转录[16]。其中使用绿色荧光标记ZsGreen除了在病毒整个包装、纯化过程中监测其包装效率及感染效率外，也有利于后期对AAV感染宿主细胞后的定位跟踪。此外，在rAAV2/9-hTSHR289-IRES-ZsGreen的制备中，病毒载体是使用了AAV2的ITRs以及全部AAV2的Rep基因，换上血清型AAV9的Cap基因。使用经过临床检验安全的AAV2的ITRs，不仅可避免使用其他血清型的ITRs可能带来的风险，而且利用血清型AAV9的衣壳蛋白可逃过AAV2抗体的中和作用并识别宿主细胞膜上不同于AAV2受体进入细胞的特征，提高转染效率[17]。本研究采用rQ-PCR法准确地测定了病毒滴度，制备了较高效价的重组 rAAV2/9-hTSHR289-IRES-ZsGreen病毒颗粒，滴度达1×1013vg/mL，并经ELISA法验证病毒包装成功及有效表达。由此，该方法建立的rAAV2/9-hTSHR289-IRES-ZsGreen杂合载体系统具有其他方法及病毒载体所不具有的优势。

本研究利用重组腺相关病毒rAAV2/9作为基因表达载体，成功制备了高效表达hTSHR289的rAAV2/9-hTSHR289-IRES-ZsGreen杂合型载体，但其进一步的体外细胞及体内动物实验，以及各靶器官的转染效率尚需深入研究，而rAAV2/9-hTSHR289-IRES-ZsGreen杂合载体有望为将来研究GD建立理想动物模型以及探索基因预防提供更佳手段。