天竺葵对脓毒症小鼠肾功能保护作用观察

陈美玲, 陈 烨, 程玉梅, 朱春玲

(贵州医科大学附属医院1. 肾内科, 2. 重症医学科, 贵阳550004)

脓毒症是因严重感染而导致的全身炎症性反应类疾病，即使在重症监护情况下其发病后的致死率仍然较高[1]。在被感染时细胞因子激活是宿主防御系统的一个重要环节。但是大量的细胞因子激活可能导致全身广泛损伤和多器官功能衰竭[2]。脓毒症可上调一氧化氮(nitric oxide, NO)和活性氧(reactive oxygen species, ROS)的产生，从而导致细胞毒性[3,4]。ROS的过量产生可引起因内源性抗氧化防御系统降低和脂质过氧化减少而导致的氧化应激反应。因此认为具有抑制ROS和炎性细胞因子产生的药物可以治疗严重的脓毒症或脓毒症性休克[5,6]。

天竺葵是可在部分蔬菜和水果中提取出的化合物,主要化学成分为天竺葵素、天竺葵醇及精油等，具有抗氧化、抗糖尿病和细胞保护作用[7]。已有关于天竺葵抗炎症反应、抗癌症和预防糖尿病的研究报道[8]，但是天竺葵对脓毒症患者的肾功能保护作用尚无明确定论。因此本实验研究了天竺葵对脓毒症模型小鼠的肾保护作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级雄性C57BL/6小鼠30只，(6.2±1.4)周龄，体质量(21.4±4.1) g，购自贵州医科大学[SCXK(黔)2018-0001]，饲养于贵州医科大学附属医院实验动物中心[SYXK(黔)2014-002]。

1.2 主要仪器设备和试剂

天竺葵提取物, 购自美国Sigma公司; 舒泰购自法国维克制药股份有限公司; 原发性人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)培养基购于美国生物科学公司; 白细胞介素-6(interleukin 6, IL-6)、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor-α, TNF-α)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)、总谷胱甘肽(glutathione, GSH)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)和过氧化氢酶活性(catalase, CAT)试剂盒均购自南京建成生物有限公司; 酶标仪购自美国BioTek公司; 离心机购自上海安亭科学仪器厂; 电泳仪购自美国Bio-rad公司。

1.3 小鼠脓毒症模型制作及实验处理

将30只小鼠随机分为3组，分别为对照组、模型组和天竺葵组, 每组10只。对照组小鼠正常饲养, 不做任何处理; 模型组和天竺葵组小鼠制作脓毒症模型, 造模成功后, 天竺葵组分别于造模后12 h、60 h注射天竺葵提取物(0.4 mg/kg), 共注射2次。在天竺葵第2次注射后48 h分别收集3组小鼠血液和器官样品用于功能测定。

造模方法: 采用盲肠结扎后穿孔(cecal ligation plus puncture, CLP)手术制作脓毒症模型，即将小鼠行腹腔注射麻醉(舒泰30 mg/kg)，在其腹壁正中切口，轻轻拉出盲肠，用无菌4号丝线在盲瓣于盲肠中点进行结扎，并用无菌针头在结扎部位于盲肠顶端的中点处贯穿刺盲肠壁，造成穿孔，轻轻挤压盲肠，挤出少许内容物确保穿孔通畅，然后把盲肠推回腹腔，逐层缝合。

1.4 肾损伤标志物检测

第2次注射天竺葵后48 h，提取小鼠血液、尿液及肾组织样本取样。分别检测3组小鼠的血尿素氮(blood urea nitrogen, BUN)、血肌酐、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)、中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(neutrophil gelatinaseassociated lipocalin, NGAL)、视黄醇结合蛋白(retinol-binding protein, RBP)、N-乙酰 -β-D-葡萄糖苷酶(N-acetyl-β-D-glucosidase, NAG)[9]及24 h蛋白尿水平(小鼠尿液收集方法，小鼠置于代谢笼中，禁食不禁水24 h收集尿液)。

1.5 组织炎症标志物检测

分别检测3组小鼠血浆中NO、TNF-α、IL-6及髓过氧化物酶(myeloperoxidase, MPO)水平。其中NO检测采用亚硝酸盐/硝酸盐测定, 使用Griess试剂和钒溶液测定血浆中亚硝酸盐和硝酸盐的水平。将每个样品(100 μL)与钒溶液(100 μL)混合并与Griess试剂一起孵育。半小时后，测量吸光度(A540nm)值。使用亚硝酸钠标准品制备标准曲线以测量最终浓度。TNF-α、IL-6及MPO均采用酶联免疫吸附法测定, 严格按照试剂盒说明书操作。

1.6氧化应激标志物检测

分别检测3组小鼠脂质内MDA、GSH、SOD、GSH-Px和CAT水平[9,10]。

1.7统计学方法

应用SPSS20.0软件进行统计分析。计量资料采用表示，组间比较的统计分析采用重复因素方差分析检验，方差不齐采用Dunnett’s检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组小鼠肾脏损伤标志物水平比较

与对照组比较，模型组BUN 、血肌酐、尿蛋白、LDH、NGAL、RBP及NAG水平均显著升高(P＜0.05); 天竺葵组BUN、血肌酐、NGAL、RBP及NAG水平显著升高(P＜0.05)。与模型组比较，天竺葵组BUN、血肌酐、尿蛋白、LDH、NGAL、RBP及NAG水平显著降低(P＜0.05)(表1)。

表 1 三组小鼠肾脏损伤标志物水平比较

2.2三组小鼠肾组织炎症标志物水平比较

与对照组比较，模型组及天竺兰组N O、TNF-α、IL-6及MPO水平均显著升高(P＜0.05)。与模型组比较，天竺兰组NO、TNF-α、IL-6及MPO水平均显著降低(P＜0.05)(表2)。

2.3 三组小鼠氧化应激标志物比较

与对照组比较，模型组MDA水平显著升高，GSH、SOD、GSH-Px及CAT水平均显著降低(P＜0.05); 天竺葵组MDA水平显著升高(P＜0.05)。与模型组比较，天竺葵组MDA水平显著降低，GSH、SOD、GSH-Px及CAT水平均显著升高(P＜0.05)(表3)。

表 2 三组小鼠肾组织炎症标志物水平比较

表 3 三组小鼠氧化应激标志物比较

3 讨论

对人类脓毒症的研究因复杂的病理生理学过程、人群的多样性、诊断标记物的不充足以及伦理限制等多重复杂原因而受到限制[11,12]。CLP模型被认为是多菌脓毒症的金标准模型，可以模拟人类脓毒症[13]。

BUN 、血肌酐、尿蛋白及LDH是肾损伤检测的基础指标。NGAL是急性肾损伤的早期诊断标志物, 可用于预测慢性肾脏疾病的进展; RBP能早期发现肾小管的功能损害，并能灵敏反映肾近曲小管的损害程度，可作为肾功能早期损害和监护治疗的指标, 还可作为肝功能早期损害和监护治疗的指标。NGAL是一种细胞内溶酶体酶，以肾近曲小管含量最高，尿、血清和唾液中NAG活性变化与肾脏状态密切相关。检测三组小鼠肾损伤上述标志物，结果表明，天竺葵注射治疗能够显著降低造模后小鼠BUN、血肌酐、尿蛋白、LDH、NGAL、RBP及NAG水平。说明天竺葵能够对脓毒症肾损伤起到保护作用。党璇等[14]对天竺葵的药理活性研究表明, 其具有肾保护作用。

对三组小鼠肾组织炎症标志物及氧化应激标志物检测表明，天竺葵注射治疗能够显著降低造模后小鼠炎症标志物NO、TNF-α、IL-6及MPO水平; 提高氧化应激标志物GSH、SOD、GSH-Px及CAT水平，降低氧化应激标志物MDA水平。基因编码三种抗氧化酶(SOD，CAT和GSH-Px，被认为是主要的氧化防御基因[15]。小鼠CLP手术后降低了肾脏SOD，CAT和GSH-Px的表达，但是它们通过天竺葵的注射处理后表达水平较未处理组显着增加，表明天竺葵具有针对CLP术后诱导的肾组织氧化损伤的细胞保护活性。CLP还增加肾脏MDA浓度，肾脏MDA是作为主要的脂质过氧化产物和氧化应激标记物[16]。因此，天竺葵可以通过抑制脂质中的过氧化反应和活化抗氧化酶来保护免受脓毒症诱导的氧化应激和损伤。

综上所述，天竺葵或可用于脓毒症引发的肾性疾病的治疗。