百合中王百合苷A 对土壤肥力的响应分析

袁志鹰，夏江南，刘月新，江星明∗，陈乃宏，2，4，许光明，周小江，2

（1.湖南中医药大学，湖南 长沙 410208；2.湖南省中药饮片标准化与功能工程技术中心，湖南 长沙 410208；3.湖南省药食同源功能性食品工程技术中心，湖南 长沙 410208；4.中国医学科学院北京协和医学院药物研究所，北京 100050）

百合为百合科百合属多年生草本球根植物，株高一般约70～150 cm，鳞茎为其主要药用部位，由多片肉质肥厚、卵匙形的鳞片聚合而成，具有养心安神、润肺止咳功效［1-3］。湖南龙山卷丹百合Lilium lancifoliumThunb.种植基地是我国最大的药用百合种植集中区，是龙山县的支柱产业［4-5］。卷丹百合含有酚酸、酚酸甘油酯、皂苷等多种活性成分，具有镇静催眠、抗肿瘤、抗氧化和抗炎等多种药理活性［6-8］，而课题组前期研究发现王百合苷A 在多批次百合药材均存在，因此深入研究王百合苷A 非常有意义。

土壤是中药材种植栽培的基础，更是其生长发育所需水、热、气、肥的供应者。从植物营养学和环境胁迫的角度来说，土壤肥力势必影响到中药材的有效成分含有量［9-10］，从而影响到中药方剂临床治疗效果。而土壤肥力因子种类较多，借助内梅罗综合指数法将土壤中各肥力因子的影响整合为一个指数［11-13］，可探究土壤肥力与百合药材主要活性成分的相关性。

本研究通过测试龙山县百合种植代表性基地土壤的各项肥力指标，参照国家土壤属性分级标准，运用改进的内梅罗综合指数法对土壤肥力进行综合评价，并利用UPLC方法测定对应土壤种植的卷丹百合药材中王百合苷A 的含有量，探究土壤肥力因子对百合主要化学成分王百合苷A含有量的影响，以期为卷丹百合生产基地的选址及其质量控制提供参考。

1 材料与方法

1.1 仪器与试药 Agilent 1290 Infinity 型超高效液相色谱仪（美国Agilent 公司）；KM-250DE 中文液晶台式超声波清洗器（昆山美美超声仪器有限公司）；AA-7000 原子吸收分光光度计（日本岛津公司）；TU-1900 紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；电炉（北京市永光明医疗仪器厂，功率1 000 W）；FW100 高速万能粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司）；AR124CN 电子天平（上海奥豪斯有限公司）；SMART 2 PURE 智能一体化超纯水系统（美国赛默飞世尔科技公司）。王百合苷A 对照品（0252-DT01，上海诗丹德公司）。氯化钾（优级纯，国药集团化学试剂有限公司）；乙腈为色谱纯（韩国LG 公司）；HCl、H2SO4、NaOH、K2Cr2O7等试剂均为分析纯。

1.2 样品采集 龙山百合种植基地位于湘西，海拔400～1 100 m，年均气温15.8 ℃，极端最高气温39.5 ℃，极端最低气温-6.9 ℃，年平均降雨量1 308.1 mm，年均日照时数1 153.6 h，全年无霜期285 d。2017 年7 月，在野外详细调查的基础上，选取5 块典型田地为研究对象（2 块必须轮作才能种植百合，3 块连续3 年连作都能种植百合）。土壤样品按照“S”型5 点采样法，采集0～30 cm 土壤，混合均匀，去除植物根系和石块等，自然风干磨细后，分别过孔径1 mm 和0.25 mm 筛，装入保鲜袋备用。

卷丹百合地下鳞茎分别采自对应的研究田地，由湖南中医药大学中药系周小江教授鉴定为百合科百合属植物卷丹Lilium lancifoliumThunb.的新鲜鳞茎，洗净后干燥粉碎，过100 目筛备用。具体见表1。

表1 样品信息

1.3 土壤测定方法 本研究选择土壤主要的7 个肥力指标（土壤有机质、全N、全P、全K、有效P、水解性N、速效K）作为研究内容，土壤有机质采用外加热-重铬酸钾容量法（NY／T 1121.6-2006），土壤全N 采用半微量开氏法（NY／T53-1987），土壤全P 采用标准（森林土壤磷的测定LY／1232-2016），土壤全K 采用标准（森林土壤钾的测定LY／T 1234-2014），土壤有效P 采用标准（NY／T 1121.7-2014），土壤水解性N 采用标准（LY／T 1228-2015），土壤速效K 采用标准（LY／T 1234-2015）进行测定。

1.4 UPLC 测定方法

1.4.1 色谱条件 Agilent Eclipse Plus C18柱（2.1 mm×50 mm，1.8 μm）；流动相乙腈（A）-0.5% 磷酸（B），梯度洗脱（0～15.2 min，1%～10% A；15.2～15.5 min，10%～15% A；15.5～17.5 min，15%～25% A；17.5～19.5 min，25%～30% A；19.5～22 min，30%～40% A；22～25 min，40%～75% A；25～27 min，75%～90%A；27～29 min，90%～95%A；29～31 min，95%～1%A）；体积流量0.20 mL／min；柱温30 ℃；检测波长308 nm；进样量2.0 μL。

1.4.2 供试品溶液制备 精密称取0.5 g 过100 目筛的药材粉末，加入30 mL 80%乙醇，静置1 h，超声40 min 后过滤，即得。

1.4.3 对照品溶液制备 精密称取王百合苷A 对照品置于量瓶中，加80% 乙醇溶解稀释，配制成质量浓度为0.560 mg／mL的溶液，即得。

1.4.4 线性关系考察 精密量取王百合苷A 对照品置于量瓶中，加入80% 乙醇溶解，摇匀，稀释配成质量浓度为0.5、10、50、100、350、600 μg／mL 的系列标准溶液。在“1.4.1”项条件下进样，记录色谱峰面积。以峰面积为纵坐标（Y），对照品质量浓度为横坐标（X），进行线性回归。得王百合苷A 回归方程为Y=0.048 4X+2.568 6（r=0.999 5），在0.5～600 μg／mL 范围内线性关系良好。

1.4.5 方法学考察 对方法的精密度、稳定性、重复性及加样回收率考察，结果表明各指标均符合含有量测定要求，加样回收图见图1。

图1 王百合苷A UPLC 色谱图

2 结果与分析

2.1 土壤肥力测定 土壤样品主要肥力指标测定结果见表2。在5 个样品中，含有量分别为有机质14.3～25.6 g／kg、全氮0.93～1.69 g／kg、全磷0.18～1.14 g／kg、全钾10.6～26.9 g／kg、有 效 磷7.4～93.8 mg／kg、水 解 性 氮60.3～159.0 mg／kg、速效钾52.0～259.0 mg／kg。对土壤中有机质、全氮、全磷、全钾、有效磷、水解性氮、速效钾变异系数（CV）［14］的分析发现，龙山百合种植土壤中有效磷的变异系数属于强变异（CV≥90%），由此可知，龙山县百合栽培土壤中有效磷的含有量差异巨大；全氮、全磷、全钾、水解性氮、速效钾均属于中等强度变异（20% ＜CV＜90%），这几种成分的含有量在土壤中具有一定的稳定性。有机质含有量变异系数为20%最小，含有量最为稳定。

表2 土壤主要肥力指标及变异系数

2.2 肥力因子等级划分 根据《全国第二次土壤普查标准》，对龙山百合种植基地土壤养分肥力进行分级，得到样品土壤中各养分指标的等级，见表3。

表3 土壤样品养分等级

由表3 可知，基地土壤中有效磷及速效钾的含有量极高，达到农作物耕地土壤的一二级标准，处于上等水平；有机质、全磷、全氮、水解性氮和全钾的含有量适中，位于第三等级，处于中等水平。

2.3 综合评价 土壤肥力采用改进的内梅罗综合指数法进行综合评价。主要因子包括有机质、全氮、水解性氮、全磷、有效磷、全钾和速效钾。对上述参数进行标准化计算，以消除各参数间差别，处理方法［11］见表4。

表4 土壤肥力等级划分

其中，Pi称为分肥力系数，Ci为该属性测定值。土壤各属性因子的分级标准（Xa、Xc、Xp）主要参照《全国第二次土壤普查标准》划分，见表5。

表5 第二次全国土壤普查划分

采用改进的内梅罗综合指数法作为评价模型对龙山百合种植基地土壤肥力质量进行综合评价，计算式［11］为

式中，P为土壤综合肥力系数，Pi平均值为土壤各属性分肥力系数的平均值，Pi最小为各分肥力系数中最小值。n为参与评价的土壤属性个数。最后根据修正的内梅罗公式计算的综合肥力系数（P）给出土壤的肥力评价，评价标准如下，P≥2.7，很肥沃；P1.8～2.7，肥沃；P0.9～1.8，一般；P＜0.9，贫瘠。见表6。

结果表明，土壤1 与土壤2 综合肥力系数最低，处于贫瘠水平，与当地药农采取轮作的方式相符，而土壤3～5的综合肥力系数相对较高，属于一般肥力水平，亦与药农采取连作的栽培方式相符。但总体来看，5 个土壤样品的综合肥力系数均低于1.8，值得关注。

表6 土壤综合评价结果

2.4 土壤肥力因子与王百合苷A 的相关性 分别精密称取5 份不同采样点的龙山卷丹百合，按“1.4.2”项下方法制备供试品溶液，在“1.4.1”项条件下进样，测定王百合苷A 含有量，每份样品平行2 次，重复测定2 次，结果见表7，通过SPSS、EXCEL 软件分析肥力因子与百合主要活性成分王百合苷A 的相关性，拟合方程结果和响应关系图，见表7、图2。结果显示，王百合苷A 和土壤综合肥力系数呈负相关响应，可用环境胁迫理论［15］来进行解释。黄璐琦等［16］提出，逆境可能更利于中药道地性的形成，较差的土壤条件迫使百合中部分次生代谢产物含有量增加以增加对恶劣环境的耐受。

表7 王百合苷A 含有量及土壤肥力相关性

图2 王百合苷A 含有量与土壤综合肥力系数响应图

3 讨论

通过对各肥力指标的变异系数和等级划分可知，龙山百合种植土壤中有效磷的平均水平达到一级肥力标准而其变异系数为90%，属于强变异，表明该地有效磷含有量丰富但分布不均匀，可能与该地的地表形态与人工施肥不均有关。全氮、全磷、全钾、水解性氮、速效钾均属于中等强度变异，有机质含有量变异系数为20%，属于低强度变异，表明当地种植土壤有机质分布较为均匀，其中速效钾的含有量达到二级肥力标准，含有量极高；全磷、全钾、全氮、水解性氮、有机质含有量处于三级肥力标准，处于中等水平。

本研究对湖南龙山县卷丹百合种植基地土壤的主要肥力指标综合性评价研究，结果显示，龙山县卷丹百合种植基地土壤肥力处于一般水平；从单个土壤样品的综合肥力系数来看，土壤1 与土壤2 综合肥力系数最低，处于贫瘠水平，与当地药农采取轮作的方式相符，而土壤3～5 的综合肥力系数相对较高，属于一般肥力水平，亦与药农采取连作的栽培方式相符。因此，中药材种植与其土壤综合肥力系数具有高度关联性，需引起进一步关注。

改良的内梅罗综合指法计算土壤肥力综合系数P，并与百合主要成分王百合苷A 的含有量进行SPSS／EXCEL 相关性响应分析。本实验中选定的5 块代表性土壤样品的肥力因子与王百合苷A 呈负相关响应，可能较差的土壤条件迫使百合中主要的次生代谢产物—王百合苷A 含有量增加，以增加对恶劣环境的耐受。