不同产地穿山龙中薯蓣皂苷元比较

孙传菊 ，葛重宇，于长杰，杨燕飞，沈玉萍∗，杨 欢∗

（1.无锡市第三人民医院药学部，江苏 无锡 214000；2.江苏大学药学院，江苏 镇江 212013；3.镇江市食品药品监督检验中心，江苏 镇江 212050）

穿山龙收载于2015 年版《中国药典》一部，为薯蓣科植物穿龙薯蓣Dioscorea nipponicaMakino的干燥根茎，于春、秋二季采挖，洗净，除去须根和外皮，晒干，具有祛风除湿、舒筋通络、活血止痛、止咳平喘等功效［1］。江慧等［2］优化了穿山龙中薯蓣皂苷的酶提取工艺，然而穿龙薯蓣中甾体皂苷的种类较多［3］，以这些皂苷类为指标进行质量控制时需要多个对照品，且分析条件复杂，不利于开展日常检测工作。薯蓣皂苷元是穿山龙总甾体皂苷的体内代谢产物，近年来对该化合物的生物活性研究较为广泛，具有抗肿瘤［4］、提高认知功能［5］、缓解神经病理性疼痛［6］、保护甲亢性肝损害［7］等药理作用，能够通过抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶等而产生降血糖效果［8-9］，抑制甲状腺细胞增殖并缓解甲状腺肿大［10］，是该中药的质量控制指标之一，亦是制药工业中合成甾体类药物的重要中间体［11］。

在对穿山龙进行质量控制时，通常对药材进行直接酸水解［12］，或以索氏抽提法获得总皂苷后进行常压酸水解，并以石油醚从水解液中萃取薯蓣皂苷元，从而制备得到供试品溶液，然后采用HPLCUV 定量分析［13-15］。但穿山龙中含有大量的淀粉和纤维素，因而在水解过程中不得不使用高浓度酸［16］，导致薯蓣皂苷元发生脱水、异构化等副反应；索氏抽提法消耗时间长，效率较低；常压条件下反应体系达不到较高的温度，导致薯蓣总皂苷的水解不彻底，所测定的含有量偏低。

本研究建立了一种基于加压技术制备穿山龙供试品溶液的新方法，采用加压液体萃取法从穿山龙中获取总皂苷，加压两相酸水解技术萃取薯蓣皂苷元，具有耗时短、酸浓度低、得率高等优点。然后，建立了HPLC-UV 法测定薯蓣皂苷元的分析条件，进行方法学考察，并比较了10 个不同产地31批药材中薯蓣皂苷元的含有量。

1 材料

AE240 电子分析天平（万分之一，瑞士梅特勒-托利多公司）；Alpha 1-2LD 冷冻干燥机（德国Christ 公司）；HH-4 数显恒温水浴锅（国华电器有限公司）；RE-52A 旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；GSH-0.5 加压反应釜（内胆PTFE 覆膜，威海坤昌化工有限公司）；RHP-800 型高速多功能粉碎机（浙江永康荣浩工贸有限公司）；20AVp HPLC 系统（日本岛津公司）；N2000 SP1 色谱工作站（浙江大学智达信息工程有限公司）。薯蓣皂苷元对照品购自中国食品药品检定研究院（批号111539-200001）。超纯水（力康生物医疗科技控股有限公司）；乙腈为色谱纯（美国欧姆尼公司）；其他试剂均为分析纯（国药集团化学试剂有限公司）。

穿山龙于2017 年11 月至2018 年4 月采自黑龙江伊春、黑龙江尚志、吉林桦甸、吉林通化、吉林白山、辽宁葫芦岛、陕西宝鸡、河南洛阳、山东泰安和江苏镇江，并经江苏大学药学院生药学研究所陈钧教授鉴定为穿龙薯蓣Dioscorea nipponicaMakino 的根茎。药材经冷冻干燥、粉碎后过40 目筛，收集细粉，置于电子干燥箱中保存。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 沃特世Sunfire RP18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相乙腈-水（88∶12）；体积流量1.0 mL／min；柱温30 ℃；检测波长203 nm；进样量20 μL；分析时间15 min。

2.2 对照品溶液制备 精密称取薯蓣皂苷元14.00 mg，无水乙醇溶解并定容至10 mL，得到质量浓度为1 400 μg／mL 的对照品贮备液，无水乙醇2 倍稀释，依次得到质量浓度为700.0、350.0、175.0、97.50、43.75、21.88、10.94 μg／mL 的对照品溶液，并用0.22 μm 针头式微孔滤器过滤，弃去初滤液，收集续滤液，即得。

2.3 供试品溶液制备

2.3.1 加压液体萃取-加压双相酸水解法 精密称取穿山龙粉末8.00 g，按1∶4 比例与细沙混合并装填于不锈钢色谱柱中，加入50%乙醇160 mL 于80 ℃下加压萃取4 h，收集流出液，减压回收至无醇味，200 μL 浓硫酸定容至50 mL，再加入50 mL石油醚（90～120 ℃），于150 ℃下加压水解2.0 h，持续搅拌（100 r／min）。分取石油醚层，水洗至中性，减压回收溶剂至干，残留物以无水乙醇溶解并定容至100 mL，用0.22 μm 针头式微孔滤器滤过，弃去初滤液，收集续滤液，即得。

2.3.2 索氏抽提-常压酸水解法 精密称取穿山龙粉末8.00 g，加入甲醇索氏抽提24 h，减压回收溶剂至干，加入2.0 mol／L 硫酸100 mL，沸水浴中回流水解4 h，倾出，冷却后用石油醚液液萃取，减压回收溶剂，残留物以无水乙醇溶解并定容至100 mL，0.22 μm 针头式微孔滤器过滤，弃去初滤液，收集续滤液，即得。

2.4 线性关系考察 吸取10.94、21.88、43.7、97.50、175.0、350.0、700.0、1 400 μg／mL 对照品溶液，以薯蓣皂苷元峰面积为纵坐标（Y），质量浓度为横坐标（X）进行回归，得方程Y=9 715 299.5X-88 785.6（r=0.999 5），表明薯蓣皂苷元在10.94～1 400 μg／mL 范围内线性关系良好。色谱图见图1。

图1 薯蓣皂苷元HPLC 色谱图Fig.1 HPLC chromatogram of diosgenin

2.5 精密度试验 分别吸取对照品溶液（1 400、175.0、10.94 μg／mL）及供试品溶液（吉林白山），在“2.1”项条件下进样测定6 次，测得薯蓣皂苷元色谱峰峰面积RSD 分别为0.87%、0.68%、1.62%、0.92%，表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验 取吉林白山产药材制备供试品溶液，于室温下避光密闭保存，于4、8、12、24、48、72 h 在“2.1”项条件下进样测定，测得峰面积RSD 为1.68%，表明溶液在72 h 内稳定性良好。

2.7 重复性试验 取吉林白山产药材制备供试品溶液6 份，在“2.1”项条件下进样测定，测得薯蓣皂苷元含有量RSD 为1.85%，表明该方法重复性良好。

2.8 加样回收率试验 称取吉林白山产药材粉末9 份，每份4.00 g，精密称定，以加压液体萃取法获取总皂苷，并加入一定量对照品，加压双相酸水解法制备供试品溶液，在“2.1”项条件下进样测定，计算回收率，结果见表1。

表1 薯蓣皂苷元加样回收率试验结果（n=3）Tab.1 Results of recovery tests for various diosgenin（n=3）

2.9 样品含有量测定 表2 表明，采用加压液体萃取-加压双相酸水解法制备供试品溶液，测得吉林白山产穿山龙中薯蓣皂苷元的平均含有量为1.612%，远高于传统的索氏抽提-常压酸水解法；而且，新方法的耗酸量及提取、水解时间均大幅降低，有利于环境保护，提高制备效率。公式如下。

增加率=｛［（加压液体萃取-加压双相酸水解法）-（索氏抽提-常压酸水解法）］／（索氏抽提-常压酸水解法）｝ ×100%。

减少率=｛［（索氏抽提-常压酸水解法）-加压液体萃取-加压双相酸水解法）］／（索氏抽提-常压酸水解法）｝ ×100%。

表2 新供试品制备方法与传统方法的比较（n=3）Tab.2 Comparison of novel method with conventional method（n=3）

然后，以加压液体萃取-加压双相酸水解法分别制备31 批10 个产地供试品溶液各3 份，测定薯蓣皂苷元色谱峰峰面积，代入回归方程，计算含有量，见图2。由图可知，供试品溶液中的薯蓣皂苷元可以与各干扰组分达到基线分离（R＞1.5）。

图2 不同产地样品HPLC 色谱图Fig.2 HPLC chromatogram of samples from different growing areas

表3 表明，穿山龙中薯蓣皂苷元的平均含有量0.695%～2.263%，其中产于黑龙江伊春的最高，而且东北三省远高于其他产地。One-way ANOVA统计分析结果见图3，可知东北三省所采集的药材中以辽宁葫芦岛产含有量最低，但也显著高于陕西宝鸡产（P＜0.05），并且极其显著高于河南洛阳、山东泰安、江苏镇江产（P＜0.01）。

3 讨论与结论

在对穿山龙药材的供试品溶液中的薯蓣皂苷元进行分析时，比较了色谱柱SunFire RP18（150 mm×4.6 mm，5 μm）、Luna C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）、Eclipse XDB C18（4.6 mm ×150 mm，5 μm），发现采用SunFire RP18色谱柱时，薯蓣皂苷元大约在10 min 出峰，时间适中，色谱峰的对称性好，并且与其他成分实现了基线分离。

在以传统技术制备穿山龙供试品溶液的过程中，常用索氏抽提法、直接酸水解法，存在耗时长、硫酸浓度高、测定含有量偏低等不足。本研究采用了加压液体萃取法和加压两相酸水解法，在加压条件下，前者可以使穿山龙中的总甾体皂苷被快速、彻底地萃取出来；后者则只需要使用低浓度硫酸，并且水解时间大为缩短，有利于保护薯蓣皂苷元的化学结构［17］，从而使含有量得以提高，并有利于环境保护，提高制备效率。

表3 不同产地样品中薯蓣皂苷元的含有量测定结果（n=3）Tab.3 Results of content determination of diosgenin in samples from different growing areas（n=3）

图3 不同产地样品中薯蓣皂苷元含有量的比较Fig.3 Comparison of contents of diosgenin in samples from different growing areas

穿山龙主要分布于东北、华北、山东、河南、安徽、浙江北部、江西（庐山）、陕西（秦岭以北）、甘肃、宁夏、青海南部、四川西北部，其中黑龙江、吉林、辽宁一直被认为是该药材的道地产区［18］。本研究测定了从以上产地采收的31 批穿山龙中薯蓣皂苷元含有量，发现东北地区显著高于其他地区，可见薯蓣皂苷元作为该药材的指标性成分，能够较好地体现其道地性。