新疆巴什拜羊不同毛色与有关基因多态性分析

包敖敦格日乐，姚力丹，曼则热·朱尔丁，梁小鹏，张振良，决肯·阿尼瓦什

(新疆农业大学动物科学学院，乌鲁木齐 830052)

0 引 言

【研究意义】被毛颜色是毛皮动物的重要特征之一。中国绵羊的颜色是白色，黑色，红棕色，黄棕色，蓝灰色和斑点。它主要包括微观多元素的调节和环境。[1]。不同毛色天然羊毛纺织原料减少化学染料对人体伤害和环境污染，降低纺织成本，利用现代分子遗传技术来分析不同毛色的遗传变异，对选育不同毛色的绵羊和提高绵羊羊毛的经济价值，对新疆养羊业的发展具有重要意义。【前人研究进展】哺乳动物的表皮结构主要由黑色素组成，黑色素是一种无定形的细颗粒，几乎不溶于所有机溶剂和水。由于基因调节，黑素细胞在不同的发育水平上发生变化。 不同的基因在不同的发育阶段会产生不同的影响[2]。哺乳动物的毛色由几种基因介导，对基因的最终表达具有不同的影响。据报道，鼠灰信号蛋白基因(Agouti - signalling Protein,ASIP)基因和酪氨酸酶相关蛋白家族基因(TYR，TYRP1和TYRP2)基因与羊毛的颜色有关[3,4]。Agouti基因编码的、脂肪组织及脑组织内表达[5]。Agouti在小鼠皮肤中表达并调节毛色，抑制黑素细胞中的MC1R信号而达到所表达的有所不同[6]。TYR基因是黑色素合成的限速酶，氨基酸在TYR的催化下，通过DOPA、多巴洛衍生物等形式生成黑色素，含有真黑素和褐黑素，真黑素通过诱导TYRP1、TYRP2、SILV酶和G蛋白而产生较深颜色的色素。研究表明酪氨酸酶活性可以影响黑色素的合成。TYR的浓度和活性过低时，所表达的是褐色素；相反TYR的浓度和活性过高时，会表达真黑色素的产生和表达[7-9]。【本研究切入点】前人在不同品种的绵羊研究过有关毛色调控的基因，但在巴什拜羊上有关毛色的研究报道较少。研究分析新疆巴什拜羊毛色与有关基因多态性分析。【拟解决的关键问题】通过对巴士拜羊羊四个基因的多态性分析，筛选出与不同毛色相关的遗传变异，为选育彩色绵羊，综合提高新疆绵羊经济性能提供参考。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 样本选择

采集塔城托里县的3种不同被毛颜色(红棕色73只，黑色53只，青灰色40只)的巴什拜羊。试验采用橼酸钠抗凝血样，储存与-20℃冰箱内用于提取DNA，试验采用酚仿抽提法提取基因组DNA。图1

1.1.2 主要试剂和药品

Tris平衡酚，氯仿异戊醇，冰无水乙醇，70%无水乙醇，2×TaqPCR MasterMix，6×Loading Buffer，DL2000，D2000，ddH2O，蒸馏水，甲醛，Tris碱，EDTA-Na2，AgNO3，NaCl，SDS，NaOH，溴化乙锭，尿素，盐酸，丙烯酰胺，甲叉双丙烯酰胺，过硫酸铵，95%去离子甲酰胺，二甲苯青，溴酚蓝，琼脂糖。

1.2 方 法

1.2.1 引物设计

参照GenBank中绵羊ASIP基因(登录号：NC_019470)、TYR基因(登录号：NC_019478)、TYRP1基因(登录号：EU760771.1)和TYRP2基因(登录号：EU760773)序列，用Primer Premier 5软件设计引物，由上海生物生物工程有限公司合成，引物序列见。将ASIP基因、TYR基因和TYRP1基因的PCR产物送至上海生工生物工程有限公司测序。表1

表1ASIP、TYR、TYRP1和TYRP2基因的引物序列、片段大小及退火温度
Table 1 Primer sequences, fragment sizes and annealing temperatures ofASIP,TYR,TYRP1 andTYRP2 genes

基因Gene引物序列(5’→3’)Primer sequence (5'→3')片段大小Fragment size退火温度TmAnnealing temperature Tm位置PositionASIPF:TACCTTGCTGGTCTGCCTGTR:CAACCCTAGCTGAGACTTCC252bp61.1℃Exon 2TYRF:CAAGCACGTCGAATCTGGR:CCGGGGACTTCAACATC257bp61℃Exon 6TYRP1F:TCCTTCTTTCTCCCTCCCR:TTCCAAGGATTCGCAGAC160bp55℃Exon 3TYRP2F:CTACAACCGCCGAGTCACR: GAACGGAGGACTGTCAAACTT145bp60℃Exon 5

1.2.2 PCR扩增体系及反应条件

PCR扩增反应总体积20 μL：DNA模板(50 ng/uL)1 μL，引物(10 pmol/uL)1 μL，2×TaqPCR MasterMix10 μL，再加入8 μL的ddH2O使总体积为20 μL。PCR程序。表2

1.2.3 PCR-SSCP检测

用变性后的产物在8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶的胶槽中点样，点好样后预跑10 min，电流180 V，电压50 mA，电泳8到12 h。

1.3 数据处理

试验运用软件PIC-CALC和POPGENE32计算巴什拜羊ASIP、TYR、TYRP1和TYRP2基因的基因型频率、等位基因频率、纯合度、杂合度、多态信息含量和有效等位基因数，并对该位点基因型的分布进行Hardy-Weinberg平衡的卡方适合性检验。

表2 PCR反应程序
Table 2 PCR reaction procedure

温度Temperature时间Time循环次数Cycles94℃预变性5 min1 Cycle94℃变性30 s退火温度30 s72℃延伸30 min }35 Cycles72℃延伸5 min1 Cycle4℃保存Pause1 Cycle

2 结果与分析

2.1 巴什拜羊基因组DNA的检测

用浓度为1.5%琼脂糖凝胶对提取的巴什拜羊基因组DNA进行检测，凝胶上的基因组DNA条带大于2 000 bp，且DNA的OD值在1.7～1.8，表明基因组DNA的完整性和纯度比较好，可作为后续的试验模板。图1

图1 DNA琼脂糖凝胶电泳检测
Fig.1 DNA agarose gel electrophoresis detection chart

2.2 巴什拜羊4种基因的PCR检测

PCR产物利用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测结果显示，扩增长度分别为:ASIP基因252 bp,TYR基因257 bp,TYRP1基因160 bp，TYRP2基因145 bp，都与目的片段长度一致，可用于后续试验。图2

2.3 基因的PCR-SSCP检测

用8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，结果表明,ASIP基因的PCR-SSCP检测结果图中有两种基因型，分别命名为AA型和AB型。TYR基因的PCR-SSCP检测结果图中可以看出有三种基因型，分别定义为AA型、AG和GG型。TYRP1基因的PCR-SSCP检测结果图中可以看出有两种基因型，分别定义为AA型和GG型。TYRP2基因的PCR-SSCP检测结果图中可以看出条带一致，没有多态。图3

2.4ASIP基因测序

研究表明，在巴什拜羊群体中发现此序列在第二外显子处发生突变。

在ASIP基因中碱基C缺失，是错义突变，导致丝氨酸突变为脯氨酸，由AA基因型突变为AB基因型。图4

图2ASIP、TYR、TYRP1和TYRP2基因PCR扩增产物检测结果
Fig.2 Detection results of PCR amplification products ofASIP,TYR,TYRP1 andTYRP2 genes

图3ASIP、TYR、TYRP1和TYRP2基因SSCP凝胶检测结果
Fig.3 Results of SSCP gel detection ofASIP,TYR,TYRP1 andTYRP2 genes

图4ASIP基因突变位点的不同峰图测序
Fig.4 Sequencing of different peak maps ofASIPgene mutation sites

2.4.1TYR基因测序结果

TYR基因由测序结果分析可知，在巴什拜羊群体中发现此序列在第六外显子处发生突变。TYR基因编码区碱基A→G发生突变，是错义突变，导致氨基酸由组氨酸突变为精氨酸，由AA基因型突变为AG基因型和GG基因型。图5

图5TYR基因突变位点的不同峰图测序
Fig.5 Sequencing of different peak maps ofTYRgene mutation sites

2.4.2TYRP1基因测序

研究表明，在巴什拜羊群体中发现此序列在第三外显子处发生突变。TYRP1基因编码区碱基A→G发生突变，是同义突变，未导致氨基酸序列的变化。图6

图6TYRP1基因突变位点的不同峰图测序
Fig.6 Sequencing of different peak maps of theTYRP1 gene mutation site

2.5 基因群体遗传结构

2.5.1ASIP基因群体遗传结构

2.5.1.1ASIP基因的基因频率和基因型频率

研究表明，在不同毛色的巴什拜羊群体中，ASIP基因存在两种基因型：AA型和AB型。AB基因型在红色被毛群体中是优势基因型，其基因型频率为0.658。AA基因型在黑色被毛群体中是优势基因型，其基因型频率为0.660。AA基因型在青灰色被毛群体中是优势基因型，其基因型频率为0.875。等位基因B为红色被毛群体中的优势等位基因；等位基因A为黑色和青灰色两种被毛群体中的优势等位基因。ASIP基因在巴什拜羊群体中处于Hardy - Weinberg平衡状态。可以看出AA基因型在黑色和青灰色群体中的个体数高于AB基因型的个体数；在红色被毛群体中AB基因型个体数高于AA基因型的个体数。ASIP-1基因的两种基因型个体数在三种不同毛色群体中差异不显著(P>0.05)。表1

表1ASIP基因型频率和等位基因频率
Table 1ASIPgenotype frequency and allele frequency

品种Breed基因纯合度(Ho)基因杂合度(He)有效等位基因数(Ne)多态信息(PIC)巴什拜红羊0.5590.4411.7900.344巴什拜黑羊0.7180.2821.3920.242巴什拜青羊0.8820.1171.1330.110

2.5.1.2ASIP基因遗传参数值

对巴什拜羊ASIP基因的纯合度、杂合度、有效等位基因和多态信息含量进行分析。ASIP基因在不同毛色的巴什拜羊群体中的遗传参数值有所不同。红色被毛的巴什拜羊中纯合度为0.559，杂合度为0.441，有效等位基因数为1.790，多态信息含量为0.343。黑色被毛的巴什拜羊中纯合度为0.718，杂合度为0.282，有效等位基因数为1.392，多态信息含量为0.242。青灰色被毛的巴什拜羊中纯合度为0.882，杂合度为0.117，有效等位基因数为1.133，多态信息含量为0.110。在此群体中，红色被毛巴什拜羊的多态信息含量为0.344，属于中度多态；黑色和青灰色被毛巴什拜羊的多态信息含量为0.242和0.110，低度多态。表2

表2 巴什拜羊ASIP基因遗传参数
Table 2 Genetic parameters ofASIPgene in Bashbai sheep

毛色Coat基因型和基因型频率Genotype and genotype frequency等位基因频率Allele frequencyAAABABX2红色0.342(25)0.658(48)0.671(121)0.329(48)2.853黑色0.660(35)0.340(18)0.830(88)0.170(18)0.136青灰色0.875(35)0.125(5)0.938(75)0.062(5)0.673

2.5.2TYR基因群体遗传结构

2.5.2.1TYR基因的基因频率和基因型频率

研究表明，在不同毛色的巴什拜羊群体中，TYR基因存在两种基因型：AA型AG型和GG型。GG基因型在此群体中是优势基因型，在红色被毛群体中的基因型频率为0.849；在黑色被毛群体中的基因型频率为0.698；在青色被毛群体中的基因型频率为0.475。AG基因型在红色被毛群体中基因型频率为0.110；AG基因型在红色被毛群体中基因型频率为0.226；AG基因型在红色被毛群体中基因型频率为0.4。AA基因型在红色被毛群体中，其基因型频率为0.041；在黑色被毛群体中的基因型频率为0.075；在青色被毛群体中的基因型频率为0.125。在此群体中等位基因G为3种毛色的优势等位基因。TYR基因在巴什拜羊黑色和青色被毛群体中处于Hardy-Weinberg平衡状态，而红色被毛群体中处于不平衡状态。AA和AG基因型在此群体中的个体数低于GG基因型的个体数。在红色被毛群体中GG基因型个体数显著高于AA和AG基因型个体数(P<0.05)；而黑色和青灰色被毛群体中AA、AG和GG基因个体数差异不显著(P>0.05)。表3

表3TYR基因型频率和等位基因频率
Table 3TYRgenotype frequency and allele frequency chart

毛色基因型和基因型频率Genotype and genotype frequency等位基因频率Allele frequencyAAAGGGAGX2红色0.041(3)0.110(8)0.849(62)0.096(14)0.904(132)9.884黑色0.075(4)0.226(12)0.698(37)0.189(20)0.811(86)3.596青灰色0.125(5)0.4(16)0.475(19)0.325(26)0.675(54)0.312

2.5.2.2TYR基因遗传参数值

对巴什拜羊TYR基因的纯合度、杂合度、有效等位基因和多态信息含量进行分析。TYR基因在不同毛色的巴什拜羊群体中的遗传参数值有所不同。红色被毛的巴什拜羊中纯合度为0.827，杂合度为0.173，有效等位基因数为1.210，多态信息含量为0.158。黑色被毛的巴什拜羊中纯合度为0.306，杂合度为0.694，有效等位基因数为1.441，多态信息含量为0.259。青灰色被毛的巴什拜羊中纯合度为0.561，杂合度为0.439，有效等位基因数为0.561，多态信息含量为0.342。TYR基因在此群体中，红色被毛多态信息含量处于低度多态，黑色和青灰色被毛多态信息含量处于中度多态。表4

表4 巴什拜羊TYR基因遗传参数
Table 4 Genetic parameters ofTYRgene in Bashbai sheep

品种 Breed基因纯合度(Ho)基因杂合度(He)有效等位基因数(Ne)多态信息(PIC)巴什拜红羊0.8270.1731.2100.158巴什拜黑羊0.3060.6941.4410.259巴什拜青羊0.5610.4390.5610.342

2.5.2.3TYRP1基因群体遗传结构

研究表明，在不同毛色的巴什拜羊群体中，TYRP1基因存在两种基因型：AA型和GG型。AA基因型在红色被毛群体中是优势基因型，其基因型频率为0.658。GG基因型在黑色被毛群体中是优势基因型，其基因型频率为0.849。AA基因型在青灰色被毛群体中是优势基因型，其基因型频率为0.950。在此群体中，红色和青灰色两种毛色中等位基因A为优势等位基因；黑色被毛群体中等位基因G为优势等位基因。巴什拜羊群体中TYRP1基因处于Hardy-Weinberg平衡状态。在巴什拜羊红色和青灰色被毛群体中AA基因型的个体数高于GG基因型的个体数；在巴什拜羊黑色被毛群体中GG基因型的个体数低于AA基因型的个体数。TYRP1基因的两种基因型个体数在三种不同毛色的群体中差异不显著(P>0.05)。表5

表5TYRP1基因型频率和等位基因频率图表
Table 5TYRP1 genotype frequency and allele frequency chart

毛色基因型和基因型频率Genotype and genotype frequency等位基因频率Allele frequencyAAGGABX2红色0.658(48)0.342(25)0.658(96)0.342(50)3.11黑色0.151(8)0.849(45)0.151(16)0.849(90)28.84青灰色0.950(38)0.050(2)0.950(76)0.050(4)0.02

2.5.2.4TYRP1基因遗传参数值

对巴什拜羊TYRP1基因的纯合度、杂合度、有效等位基因和多态信息含量进行分析。红色被毛的巴什拜羊中纯合度为0.550，杂合度为0.450，有效等位基因数为1.819，多态信息含量为1.297。黑色被毛的巴什拜羊中纯合度为0.744，杂合度为0.256，有效等位基因数为1.345，多态信息含量为0.223。青灰色被毛的巴什拜羊中纯合度为0.905，杂合度为0.095，有效等位基因数为1.105，多态信息含量为0.090。从表6可知TYRP1基因在此群体中，红色被毛多态信息含量处于高度多态，黑色和青灰色被毛多态信息含量处于低度多态。表6

表6 巴什拜羊TYRP1基因遗传参数
Table 6 Genetic parameters of TYRP1 gene in Bashbai sheep

品种Breed基因纯合度(Ho)基因杂合度(He)有效等位基因数(Ne)多态信息(PIC)巴什拜红羊0.5500.4501.8191.297巴什拜黑羊0.7440.2561.3450.223巴什拜青羊0.9050.0951.1050.090

3 讨 论

基因调控系统对色素的形成有重要作用，以及导致色素沉着的基因，决定色素颗粒的颜色基因，不作用于色素，影响毛发的颜色强度的颜色基因，基因决定羊毛的色素分布[10]。黑色素和棕色黑色素是由毛囊的黑色素细胞产生的，它们的比例决定了哺乳动物毛发的颜色[11]。

棕色黑色素和黑色的出现表明真黑色素的沉积量大，红色头发的外观表明棕色色素的沉积很大，它是灰色或白色，黑色素中的黑色素细胞黑色素越来越少[12]。目前，在性染色体中未发现控制毛发颜色的基因，可以说羊毛颜色的遗传与性别无关[13]。与黑素细胞相邻的真皮乳头细胞分泌Agouti，一种作用于毛囊培养基的旁分泌信号分子，因此,α-黑素细胞刺激激素(α-MSH)不与受体结合，从而抵消黑色素的产生[14]。李洪涛等[15]研究了哈萨克羊的不同毛色，发现Agouti基因的第二外显子和第四外显子具有缺失和突变，但与哈萨克羊的颜色无显着相关。韩吉龙等[16]发现藏羊的Agouti基因中只有两个SNP是缺失和突变。 白色覆盖组织的mRNA表达在同一个体中最低，但基因的两个突变和拷贝数与毛色无关。

在乌骨羊的TYR基因的研究中发现有两处同义处变在第一外显子中。基因型GG和GC与绵羊黑骨血液中酪氨酸的活性成分有关。研究表明，CC基因型个体具有较高的酪氨酸活性[17]。李世军等[18]实时定量PCR用于研究TYR基因与白羽和黑鸭羽毛之间的关系。发现TYR基因在黑色羽毛中的表达比白色羽毛高100倍。研究认为TYR的表达水平在黑鸭的羽毛中很高。姜俊兵等[19]采用半定量PCR方法检测了TYR基因在不同羊驼皮肤组织中的表达，发现白色被毛羊驼中TYR基因的表达水平低于有色被毛羊驼的表达水平，表明在羊驼TYR基因对被毛颜色具有调节作用。

参与不同被毛颜色调控的基因中也有TYRP1基因。在一对非洲裔美国人的双卵双胞胎中(一个有白化病，一个有正常的肤色)，发现TYRP1基因的第六个外显子缺少碱基，导致编码氨基酸密码子的变化，这导致多肽的形成。黑色素合成过程中酪氨酸酶 (TYR)是关键酶，酪氨酸酶相关蛋白1 (TYRP1)，酪氨酸酶相关蛋白2 (TYRP2)各自催化特异的反应[20]。王秋枫等(2003)[21]研究发现，鼠TYRP1与人的TYRP1同源性为93%，鼠TYRP2与人TYRP2同源性为84%。

酪氨酸酶、TYRP1和TYRP2三者之间的同源性人约为40%。黑色素合成途径中TYRP1和TYRP2是具有调控作用。这三种蛋白编码不同，在染色体上定位不同，在黑色素合成过程中起的作用不同，但在序列上有一些同源性，共同构成了“酪氨酸酶蛋白家族”[20]。

研究分析了ASIP、TYR、TYRP1和TYRP2基因由测序结果分析表明，氨基酸序列中的碱基缺失会导致基因的多态性。木合依扎·热很别克等[23]在哈萨克羊上的研究结果与研究结果一致。在巴什拜羊群体中由于基因突变而出现了毛色的表现型有所不同。不同颜色的被毛出现是由于机体内黑色素和褐黑素的表达量不同而不同。ASIP、TYR、TYRP1和TYRP2基因对黑色素和褐黑素具有调控作用。具体调控机制有待进一步研究。

4 结 论

4.1ASIP基因和TYRP1基因都有两种基因型；分别有纯合子AA、杂合子AB和纯合子AA、GG两种基因型。TYR基因有三种基因型为AA型、AG型和GG型。

4.2ASIP基因和TYRP1基因在巴什拜羊群体中都处于Hardy-Weinberg平衡状态；TYR基因在巴什拜羊红色被毛群体中处于Hardy-Weinberg不平衡状态；TYR基因在巴什拜羊黑色和青色被毛群体中处于Hardy-Weinberg平衡状态。

4.3ASIP基因此群体中，红色被毛多态信息含量为中度多态；黑色和青灰色被毛多态信息含量为低度多态。TYR基因在此群体中，红色被毛多态信息含量处于低度多态，黑色和青灰色被毛多态信息含量处于中度多态。TYRP1基因在此群体中，红色被毛多态信息含量处于高度多态，黑色和青灰色被毛多态信息含量处于低度多态。

4.4TYRP2基因PCR-SSCP检测结果没有显示多态。

4.5ASIP、TYR、TYRP1和TYRP2基因多态性与巴什拜羊的毛色性状有相关性。