不同剂量原花青素对两岁伊犁马抗氧化的影响

董亚菲，孟 军，王建文，曾亚琦，孔麒森，褚洪忠，姚新奎，葛世萌，张凯丽，任 湘，黄晶晶

(1.新疆农业大学动物科学学院，乌鲁木齐 830052；2.新疆农业大学马产业研究院，乌鲁木齐 830052；3.新疆驰霄博骏畜牧业有限公司，乌鲁木齐 830052；4.新疆伊犁哈萨克自治州畜牧科学研究所，新疆伊宁 835000)

0 引 言

【研究意义】原花青素作为绿色饲料添加剂，在美国、澳大利亚和欧洲作为马的补充剂出售，通过试验认识补饲不同剂量组原花青素对伊犁马抗氧化能力的作用效果，深入探讨其作用机理，并选择出适宜的补饲剂量，对于运动马的健康具有重要的理论价值与实践意义，也可以为运动马饲料添加剂的研发做参考依据，为运动型伊犁马的日常生产提供数据支持，为马匹健康养殖提供技术理论依据。【前人研究进展】原花青素是由儿茶素和表儿茶素两种单体以低聚或多聚形式结合而成的酚类化合物[1]。研究表明,原花青素具有与较高的食用安全性[2]，还具有提高机体免疫力[3,4]、抗炎[5]、抗肿瘤[6]减小氧化损伤[7,8]的功效,同时有研究表明补饲原花青素对马匹健康、摄取和消化无不利影响[9]。【本研究切入点】目前国内对补饲原花青素对运动马影响的研究很少，并没有针对原花青素对运动马抗氧化影响做出研究。试验通过补饲不同剂量原花青素的伊犁马运动前后抗氧化指标的变化规律，研究原花青素对运动型马匹抗氧化的影响。【拟解决的关键问题】通过分析不同剂量组马匹运动前后抗氧化指标以及免疫指标的变化规律，量化原花青素的补饲剂量，为运动型马匹科学饲养管理提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 试验动物

试验地点位于新疆伊犁哈萨克自治州昭苏县西域天马文化园。选取年龄为 2岁、平均体重为(328.28±10.21)kg，比赛成绩为(78.37±3.83)s的健康的伊犁马公马作为试验动物。

1.1.2 器材

日立 7600 系列自动生化分析仪、UNICO 7200可见分光光度计、HH-4恒温水浴箱、Labsystems Finnpipette单道芬兰移液器、华东电子DG5033A酶标仪等。

1.2 方 法

1.2.1 试验设计

将所选马匹随机分为 4 组，每组4 匹。每匹马每天补饲 4 kg 精料(分两次饲喂，每次 2 kg)，每次补精料的时间为 08: 30、22: 20。对照组精料中不添加原花青素，试验 I 组、II 组和 III 组精料中分别添加20、40和60 mg/kg BW的原花青素。

1.2.2 样品采集及处理

在试验的第28 d进行1 000 m速度赛。并于赛前30 min、赛后即刻、赛后30 min、赛后90 min、赛后24 h，采集静脉血两管。将两管血液样本静置后，使用离心机进行3 500 r/min 离心 15 min 分离血清，分离后将血清置于 -20℃ 保存待测。

1.2.3 测定指标

采用华东电子酶标仪测定超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性、采用可见分光光度计丙二醛(MDA)浓度。

1.3 数据处理

试验数据用 Excel 进行整理，运用 SPSS 21.0 软件对测定数据进行单因素方差分析(One - way ANOVA)，结果以平均数 ± 标准差表示。

2 结果与分析

2.1 静息状态饲喂剂量对抗氧化指标的影响

研究表明,SOD 活性添加20 mg /kg BW剂量组、40 mg /kg BW剂量组和60 mg /kg BW剂量组时显著高于对照组(P<0.05)；GSH-PX 活性添加60 mg /kg BW和40 /kg BW剂量组显著高于对照组(P<0.05)；MDA含量随着补喂剂量的增加呈现降低的趋势，但差异不显著(P>0.05)。表1

表1 血清中抗氧化指标随补饲浓度的变化
Table 1 Changes of antioxidant index in serum with supplementary feeding concentration

0 mg /kg BW20 mg /kg BW40 mg /kg BW60 mg /kg BWSOD(U/mL)51.8±1.07b52.59±1.12a52.79±1.18a54.31±1.29aCAT(U/mL)1.06±0.081.11±0.081.19±0.081.05±0.08GSH-PX(U/mL)175.01±7.82b188.53±7.33ab198.71±7.22a193.11±7.82aMDA(nmol/mL)4.12.±0.323.98±0.293.66±0.293.35.±0.32

注：同行不同大写字母表示极显著差异，P<0.01；同行不同小写字母表示显著差异，P<0.05。下同

Note:Different capital letters in one row extremely significant differencesp<0.01,different lowercase letters show significant differencesp<0.05.The same as below

2.2 运动后即刻饲喂剂量对抗氧化指标的影响

研究表明,SOD活性试验I组、试验II组和试验III组均显著高于对照组(P<0.05)，试验I组、试验II组、试验III组之间无显著差异(P>0.05)；CAT活性试验III组显著高于对照组(P<0.05)，其他各组之间无显著差(P>0.05)；GSH-Px活性试验I组、试验II组和试验III组显著高于对照组(P<0.05)，试验I组、试验II组、试验III组之间无显著差异(P>0.05)；MDA含量随着补喂剂量的增加呈现降低的趋势，试验III组时含量最低，但差异不显著(P>0.05)。表2

表2 血清中抗氧化指标随补饲浓度变化
Table 2 Changes of antioxidant index in serum with supplementary feeding concentration

0 mg /kg BW20 mg /kg BW40 mg /kg BW60 mg /kg BWSOD(U/mL)58.4±2.1559.53±2.2660.29±2.3363.36±2.39CAT(U/mL)1.33±0.091.35±0.091.37±0.081.37±0.08GSH-PX(U/mL)188.9±6.82189.45±6.64199.53±6.46200.98±6.26MDA(nmol/mL)4.44±0.344.34±0.354.08±0.323.8±0.33

2.3 运动后30 min饲喂剂量对抗氧化指标的影响

研究表明,SOD活性试验III组显著高于对照组(P<0.05)，试验I组、试验II组和试验III组之间无显著差异(P>0.05)；CAT、GSH-Px活性随着补喂剂量的增加呈现升高的趋势，试验III组活性最高，但各组间差异不显著(P>0.05)；MDA含量随着补喂剂量的增加呈现降低的趋势，试验III组显著低于对照组(P<0.05)，对照组、试验I组和试验II组之间无显著差异(P>0.05)。表3

表3 血清中抗氧化指标随补饲浓度变化
Table 3 Changes of antioxidant index in serum with supplementary feeding concentration

0 mg /kg BW20 mg /kg BW40 mg /kg BW60 mg /kg BWSOD(U/mL)54.54±5.37b55.21±4.29ab55.86±4.95ab58.84.±5.46aCAT(U/mL)1.12±0.071.24±0.081.27±0.071.3±0.07GSH-PX(U/mL)180.22±9.34b183.03±8.65ab182.13±8.65ab218.52±8.65aMDA(nmol/mL)3.88±0.26a3.61±0.24ab3.66±0.24ab3.13±0.25b

2.4 运动后90 min饲喂剂量对抗氧化指标的影响

研究表明,SOD 活性添加60 mg /kg BW剂量组时显著高于对照组(P<0.05)；GSH-PX 活性添加60 mg /kg BW剂量组极显著高于40 mg /kg BW剂量组、20 mg /kg BW剂量组和对照组(P<0.01)；CAT的活性随着补喂剂量的增加呈现升高的趋势，但差异不显著(P>0.05)。表4

表4 血清中抗氧化指标随补饲浓度变化
Table 4 Changes of antioxidant index in serum with supplementary feeding concentration

0 mg /kg BW20 mg /kg BW40 mg /kg BW60 mg /kg BWSOD(U/mL)52.56±1.99b54.49±2.03ab55.05±2.17ab57.08±2.17aCAT(U/mL)1.15±0.071.19±0.071.24±0.081.31±0.08GSH-PX(U/mL)183.34±8.87B187.32±8.21B190.67±8.21B228.97±8.21AMDA(nmol/mL)3.84±0.294.04±0.293.5±0.313.48±0.31

2.5 运动马运动后24 h饲喂剂量对抗氧化指标的影响

研究表明,SOD活性试验III组显著高于对照组(P<0.05)，试验I组、试验II组和对照组之间差异不显著(P>0.05)；CAT活性随着补喂剂量的增加呈现升高的趋势，试验II组时活性最高，但差异不显著(P>0.05)；GSH-Px活性试验III组显著高于对照组(P<0.05)，试验I组、试验II组和试验III组各组之间差异不显著(P>0.05)；MDA含量随着补喂剂量的增加呈现降低的趋势，试验III组含量最低，但各组间差异不显著(P>0.05)。表5

表5 血清中抗氧化指标随补饲浓度变化
Table 5 Changes of antioxidant index in serum with supplementary feeding concentration

0 mg /kg BW20 mg /kg BW40 mg /kg BW60 mg /kg BWSOD(U/mL)51.60±4.27b52.86±4.60ab53.66±4.38ab55.84±4.41aCAT(U/mL)1.10±0.321.12±0.331.13±0.251.19±0.38GSH-PX(U/mL)180.22±9.34b183.03±8.65ab182.13±8.65ab218.52±8.65aMDA(nmol/mL)3.96±0.423.9±0.483.74±0.423.45±0.46

3 讨 论

机体在正常生理状态下，自由基产生的速度和其消除的速度会保持动态平衡，促进了机体的正常代谢，但是当机体剧烈运动时，其平衡有可能会被打破[10]，如果自由基产生过量就会损害机体[11]。对比原花青素、茶多酚、VC、E和胡萝卜素清除自由基的能力，发现原花青素的效果更好[12,13]。Natella[14]研究显示葡萄籽原花青素可以通过减少氧化剂和增加抗氧化剂水平增强机体抗氧化能力。SOD、GSH-Px、CAT是机体清除自由基的主要酶类，MDA是因氧自由基引发的脂质过氧化反应的重要产物，其含量是衡量自由基对机体氧化损伤程度的指标之一。

SOD是机体清除超氧化物阴离子自由基的一种非常重要的酶，是一种催化超氧化物发生歧化反应产生氧气和过氧化氢的酶[15]。SOD可归类为金属酶，通过催化相同的化学反应对相同的底物发挥作用，不仅氨基酸序列不同，而且成分也不尽相同[16]。SOD通过清除超氧阴离子，从而阻止 NO 与超氧阴离子结合，从而防止过氧亚硝酸盐的形成，SOD 提高了 NO 的生物利用度，防止形成具有有害生物效应的强氧化剂[16]。CAT特有的阳离子，与活性氧相互作用的结果。过氧化氢酶通常的生理作用是在其引起细胞损伤之前清除 H2O2。李向果等[17]研究表明，小鼠灌胃相应剂量的原花青素可以显著提高小鼠机体中 SOD、CAT、GSH-Px 活性，降低 MDA含量，且对脏器指数没有影响，对小鼠没有毒害作用。在王颖等[18]给小鼠连续饲喂含葡萄籽原花青素的饲料28 h的试验中，测定全血和肝组织中SOD和GSH-Px活力以及MDA含量[18]，发现能够有效提高 SOD 和 GSH-Px 活性，降低MDA 含量。此次试验中马匹赛前赛后SOD的活性随着补饲剂量的增加出现升高趋势，与前人研究基本一致。CAT的活性随着补喂剂量的增加呈现升高的趋势，但差异不显著(P>0.05)，这与前人研究不同，可能是试验设计不一致或饲喂时间不同造成的，具体的作用机制还有待进一步研究。GSH-PX是在线粒体、细胞质和细胞膜中发现的另一种内源性抗氧化酶，可代谢过氧化氢和其他有机过氧化物，并对其作为电子供体的底物谷胱甘肽具有特异性谷胱甘肽过氧化物酶也被认为是一种含4个相同亚基的硒酶或四聚体蛋白，每个亚基含有硒代半胱氨酸残基，作为氧化还原催化剂[19]。GSH-Px还可促使有毒的过氧化物还原成没有毒性的羟基化合物，进而使过氧化物减少对细胞膜结构和功能的损害。刘畅等[20]对进行力竭运动小鼠的研究中发现，实验组小鼠游泳的时间明显高于对照组，肝脏中的GSH-Px的活性实验组高于对照组。此次试验中马匹赛前赛后GSH-Px的活性随着补饲剂量的增加出现升高趋势，与前人研究基本一致。

MDA是因氧自由基引发的脂质过氧化反应的重要产物，MDA的含量是衡量自由基对机体氧化损伤程度的指标之一。脂质过氧化、脱氧核糖与羟自由基的反应、碳水化合物的循环和前列腺素合成途径是全身 MDA 浓度的主要来源[21]。孙君志等[22]的研究显示，大鼠在大强度及中等强度运动中，血清丙二醛含量在运动后均出现了增高。对猪补饲高粱原花青素，发现高粱原花青素能够显著增加其抗氧化能力并且能够降低血清丙二醛含量(P<0.05)[12,13]。试验中，马匹在静息状态运动后30 min：MDA含量添加60 mg /kg BW剂量组显著低于对照组(P<0.05)，与前人研究一致。试验表明，补饲原花青素可通过提高SOD、GSH-Px活性，降低过氧化反应的产物MDA从而提高马匹抗氧化能力。

4 结 论

试验通过对伊犁马补饲不同剂量的原花青素，对伊犁马1 000 m速度赛前后抗氧化指标分析发现，随着补饲量的增加，在运动后即刻血清中SOD、CAT和GSH-Px活性显著提高(P<0.05)；运动后30 min SOD活性试验III组显著高于对照组(P<0.05)，MDA含量试验III组显著低于对照组(P<0.05)；运动后90 min SOD活性试验III组显著高于对照组(P<0.05)；运动后24 h SOD活性试验III组显著高于对照组(P<0.05)，GSH-Px活性试验III组显著高于对照组(P<0.05)。说明补饲剂量可影响伊犁马抗氧化性。伊犁马日粮中建议添加60 mg/kg BW原花青素，对提高速度型伊犁马的抗氧化能力效果良好。