亚油酸对角质形成细胞屏障相关蛋白表达的影响

姚骐羽 罗 阳 姚 煦 刘 军

皮肤是人体最大的生物屏障，皮肤脂质是皮肤重要的组成成分之一，在维护皮肤的屏障功能，防止透皮水丢失和外界环境物质的侵入中发挥了至关重要的作用[1]。表皮来源的脂质主要由50%的神经酰胺、25%的胆固醇、15%的游离脂肪酸以及少量的胆固醇酯和硫酸胆固醇组成[2]。亚油酸(linoleic acid，LA)是人类表皮含量最多的脂肪酸，也是神经酰胺的前体。亚油酸是一种不饱和脂肪酸，可以代谢为亚麻酸(γ-linolenic acid，GLA)，前列腺素(prostaglandin, PG)E1和花生四烯酸(arachidonic acid, AA)，对于生长、繁殖、皮肤功能都有重要作用。研究发现，亚油酸缺乏引起角蛋白K6、K16和K17增殖，诱导炎症反应发生[3]。研究发现，局部应用生理脂质可以提高渗透性屏障的稳态并用于治疗皮肤疾病。含LA和神经酰胺的保湿剂对银屑病的治疗有一定的缓解作用[4]。含LA的乳剂均可显著改善特应性皮炎患者的屏障功能障碍[5]。此外，LA还可以抑制皮肤色素沉着，起到美白保湿的作用[6]。以上研究表明LA对维持表皮动态平衡和角质层渗透屏障起重要作用。角质形成细胞结构功能相关的蛋白包括丝聚合蛋白(Filaggrin，FLG)、角蛋白14(keratin 14，K14)、紧密连接蛋白(claudin-1)等。但目前并无LA对角质形成细胞屏障相关蛋白表达影响的研究报道，故本实验研究LA对角质形成细胞屏障相关蛋白的作用机制，为进一步预防和改善皮肤屏障功能提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 研究对象 取5例包皮环切术后包皮置于含有青链霉素的PBS冲洗，去除皮下脂肪，将组织剪成小块置于Dispase II酶中4℃消化过夜。第二天，用镊子夹取表皮，将表皮从真皮上撕下来，表皮进一步用含EDTA的0.25%胰酶37℃孵箱消化10 min，用完全培养基终止消化，70 μm滤网过滤，制备单细胞悬液。取大约3×105放入25 cm细胞培养瓶中，并加入KC-FSM培养基(美国Invitrogen life公司)，置于37℃和5% CO2细胞培养箱中稳定培养。每2～3天换液一次，传代培养后第三代细胞作为实验对象。该研究经医院伦理委员会批准，患者均签署知情同意书，伦理审批号2018快审第(KY001)号。

1.2 方法 LA配制：LA溶解于DMSO中，配成200 mg/mL的储备液。-20℃冰箱保存。

实验分组：将细胞接种于细胞培养板中，待细胞生长至80%时，向细胞中加入不同浓度的LA溶液(终浓度分别为2、10、20 ng/mL)，继续培养6 h，收集细胞提取RNA或者蛋白。

CCK8测定细胞活性：每孔加入10 μL CCK-8溶液(美国MedChem Express公司)，37℃孵箱培育1 h，用酶标仪检测在450 nm处的吸光度。计算公式：细胞存活率=[(As-Ab)/(Ac-Ab)]×100%。As：实验孔吸光度(含细胞、培养基、CCK-8溶液和LA)；Ac：对照孔吸光度(含细胞、培养基、CCK-8溶液，不含LA)；Ab：空白孔吸光度(含培养基、CCK-8溶液，不含细胞、不含LA)。每组实验设5个复孔。

qRT-PCR检测：TRIZOL提取各实验组RNA，反转录按照反转录试剂盒说明书操作(南京诺唯赞生物科技有限公司)，具体：5× HiScript II qRT SuperMix 4 μL，总RNA 500 ng，RNase free H2O 补充到10 μL。反应程序：50℃ 15 min，85℃ 5 s。PCR同样按照试剂盒说明书操作，反应体系20 μL，包括cDNA 1 μL，10 μmol上、下游引物各0.4 μL(引物见表1，引物序列来自Primer Bank)，SYBR Green Master 10 μL，双蒸水8.2 μL。PCR扩增条件：95℃预变性5 min；循环反应，95℃10 s，60℃ 30 s，共40个循环。融解曲线：95℃ 15 s，60℃ 60 s，95℃15 s。检测仪器为ABI7300。结果用2-△△Ct表示，其中Ct为循环值。△△Ct=实验组(Ct目的基因-Ctactin)-对照组(Ct目的基因- Ctactin)。

表1 引物序列及产物大小

Western blot检测:取上述各实验组细胞，RIPA法提取蛋白。分别取50 μg各实验组蛋白进行SDS-PAGE电泳分离，转移至PVDF膜，5%BSA室温封闭1 h，小鼠抗人Filaggrin、兔抗人keratin-14、兔抗人claudin-1(美国Biolegend公司)(1∶1 000)和β-actin(1∶1000),4℃孵育过夜，HRP标记二抗(1∶2000) 室温孵育1 h，最后经ECL 化学发光法显影，成像仪内成像，拍照。每组实验重复3次。以β-actin的表达做内参，用BandScan分析胶片灰度值。

1.3 统计学方法 所有数据资料均以(均值±SD)表示。所有数据结果采用SPSS 12.0统计软件进行分析。数据采用单因素方差分析及相关性分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 LA浓度与细胞活性的关系 LA浓度对角质形成细胞的生存率影响不明显，与不加LA组相比，角质形成细胞存活率随LA浓度的增加而略微降低，当LA浓度为20 ng/mL时，细胞可在24 h后仍维持在较高的生存率84.26%(图1)。说明LA对角质形成细胞并未造成明显损伤，但作用浓度也不宜太高。

*P<0.05;**P<0.01

2.2 qRT-PCR检测LA对屏障相关蛋白mRNA表达的影响 应用Real Time PCR检测屏障相关蛋白mRNA水平，结果显示与不加LA组相比，随着LA浓度升高，Filaggrin和keratin-14 mRNA表达逐渐升高，差异有统计学意义(P<0.05)，claudin-1的mRNA表达水平在10 ng/mL亚油酸作用下明显升高，在20 ng/mL时表达下降，这可能与LA作用浓度高时，细胞存活率受影响有关 (图2)。

2.3 Western blot检测LA对屏障相关蛋白表达的影响 Western blot结果显示(图3a、3b)，在内参β-actin表达基本一致的情况下，LA作用于角质形成细胞24 h后可明显上调Filaggrin和keratin-14的蛋白表达，且表现出明显的梯度变化趋势，与不加LA组相比差异有统计学意义(P<0.05)，而claudin-1蛋白的表达水平仅在LA 10 ng/mL时表达是增加的。

vs 0 ng/mL *,P<0.05;**,P<0.01

vs 0 ng/mL *,P<0.05;**,P<0.01

图3亚油酸对皮肤屏障蛋白表达的影响

3 讨论

亚油酸是皮肤必要的脂肪酸，通常由食物提供，但局部油脂涂抹可以渗入皮肤表层，以修复干性皮肤和由于表面活性剂而损伤的皮肤，提高脂肪酸水平，减弱皮肤深层的水分损失[7]。亚油酸有维持表皮屏障的作用，有研究表明痤疮患者粉刺中亚油酸含量低于正常人，导致粉刺形成和表皮功能障碍，炎症介质渗透[8,9]。外用亚油酸可以减轻小鼠刺激性接触性皮炎的症状[10]。此外，亚油酸还能促进皮肤伤口的愈合[11]。目前亚油酸在保湿剂、药物载体方面广泛应用，但对于具体的作用机制及浓度并不清楚。

完整的皮肤屏障是抵御外界不良因素侵扰的第一道防线，其功能主要依靠角质层形成。Filaggrin在维持皮肤上皮屏障功能中发挥重要作用。Filaggrin不仅是重要的结构蛋白，而且是天然保湿因子的主要来源[12]。角蛋白是角质形成细胞主要的结构蛋白，角蛋白keratin-14高表达是KC活化增殖的主要因素之一[13]。claudin-1是皮肤屏障功能的重要组成部分。Claudin蛋白具有多种生理功能，可以直接作用于紧密连接膜相关蛋白的鸟甘酸激酶同工酶，维持紧密连接特有的栅栏功能和屏障功能[14]。

我们的研究结果显示，2 ng/mL和10 ng/mL亚油酸作用于角质形成细胞后对细胞生存率影响很微小，而20 ng/mL的亚油酸对角质形成细胞的存活率较前两个作用浓度明显下降，因此应用浓度不应太高。对于皮肤屏障相关蛋白研究发现，随着LA浓度升高，Filaggrin、keratin-14的mRNA和蛋白表达明显上升，推测亚油酸能够促进皮肤屏障相关蛋白的表达，增加细胞间的紧密连接，增强细胞的增殖，保持角质层含水量，维持皮肤屏障的完整性和紧密性，进而起到保护和修复皮肤屏障的作用。

综上所述，亚油酸可能对皮肤屏障有一定的保护作用，将亚油酸作用药物载体或者添加到护肤品对改善皮肤有一定的作用，但作用浓度不宜太高。