虾干中AFB1毒素LC-MS/MS检测方法的建立

王小博 郑琳 郑培君

摘 要：通过对前处理方法及色谱、质谱条件的优化建立了虾干中AFB1的LC-MS检测方法。选用甲醇-水（含0.1%甲酸的5 mmol·L-1乙酸铵）为流动相，ESI+扫描模式，乙腈/水（84/16）为提取溶液，提取时间60 min，提取温度25 ℃，正己烷脱脂净化。该条件下建立的虾干中AFB1毒素检测方法快速、准确、灵敏度高。

关键词：AFB1;毒素;虾干;LC-MS/MS

Abstract：The LC-MS method for the determination of AFB1 in dried shrimp was established by optimizing the pretreatment method and the conditions of chromatography and mass spectrometry. Methanol-water （5 mmol·L-1 ammonium acetate containing 0.1% formic acid） was selected as mobile phase， ESI+ scanning mode， acetonitrile/water （84/16） as extraction solution， extraction time was 60 min， extraction temperature was 25 ℃， n-hexane degreasing and purification. Under this condition， the determination method of AFB1 toxin in dried shrimp is rapid， accurate and sensitive.

Key words：AFB1; Mycotoxin; Dried shrimp; LC-MS/MS

中图分类号：O657.63

黄曲霉毒素是黄曲霉菌、寄生曲霉菌等产毒菌株产生的次生代谢物。在天然食物中黄曲霉毒素B1（aflatoxin B1，AFB1）最易产生、存在最多、毒性最强，具有高致癌性[1]，已被国际癌症研究机构划定为Ⅰ类致癌物[2]。AFB1在自然环境中廣泛存在，其造成的农作物、动物饲料污染和病害时有发生[3]。鱼、虾等水产品摄食被AFB1污染的饲料后，可在体内蓄积，同时水产品在加工制作、储存过程中不易被消减，误食被AFB1污染的水产制品会对人类的健康构成巨大威胁。因此，为了保障水产品及消费者安全，应建立快速高效的水产制品中AFB1的检测方法，从而加强对水产制品的监测。然而，现有的针对水产制品中AFB1毒素的检测方法还较为缺乏。LC-MS/MS检测法灵敏性极高、检测限极低，准确性好，非常适合AFB1的痕量分析，近年来受到了大家的广泛欢迎[4]。本研究以虾干为研究对象，通过对色谱条件、质谱条件、毒素提取方法的优化，建立水产制品中AFB1毒素LC-MS/MS检测方法，从而为水产品中AFB1的检测提供了技术支撑。

1 材料与方法

1.1 实验材料

虾干购自佛山市市场;AFB1标准品（≥98%），Enzo，USA;甲醇（色谱纯，≥99.9%）、乙腈（色谱纯，≥99.9%）、乙酸铵、甲酸及乙酸乙酯，天津光复试剂有限公司。

1.2 实验仪器

TSQ Quantum Access液相色谱-质谱联用仪，美国Thermo Scientific公司;涡旋震荡仪，美国Scientific Industries;离心机，艾本德;氮吹仪，上海安谱科学仪器有限公司;电子天平，上海英恒。

1.3 实验方法

1.3.1 标准溶液的配制

从浓度为10 μg·mL-1的AFB1母液中取1 mL于10 mL容量瓶中，用乙腈定容，获得浓度为1 μg·mL-1的AFB1标准储备液。吸取适量AFB1标准储备液，用纯甲醇配成500 ng·mL-1的毒素标准液，然后根据需要用30%的甲醇溶液配制所需浓度的标准曲线工作液。

1.3.2 色谱条件的建立

色谱柱：Hypersil Gold（100 mm × 2.1 mm，5 μL）;

流动相：甲醇-5 mmol·L-1乙酸铵溶液（含0.1%甲酸）。进样体积：10.0 μL;进样速率：10.0 μL·s-1;采用梯度洗脱，梯度洗脱条件见表1。进样速率：250.0 μL·min-1。流动相：A甲醇，B 5 mmol·L-1的乙酸铵溶液+0.1%的甲酸溶液。

1.3.3 质谱条件的建立

对目标化合物的质谱条件进行优化，最终选取二级质谱中响应较高的子离子进行SRM的质谱条件优化。

1.3.4 样品处理

虾干剪碎后取2.00 g，置于50 mL离心管中，加入15 mL的乙腈/水（84/16）匀浆，涡旋振荡10 min

（2 000 r·min-1），超声萃取10 min，离心5 min

（7 500 r·min-1）后准确移取上清液，重复3次，合并上清液[4];60 ℃下N2吹干，用1 mL30%的甲醇溶液（含5 mmol·L-1 CH3COONH4溶液∶0.1%甲酸=3∶7;V∶V）溶解，加入5 mL正己烷7 000 r·min-1离心

5 min进行脱脂，用一次性注射器取下层液过0.22 μm滤膜于进样小瓶中。

1.3.5 方法学验证

（1）线性。空白样品中加入AFB1的标准溶液，AFB1的浓度范围为0.5～100 ng·g-1。

（2）准确度和精密度。准确度用AFB1的提取

回收率表示，精密度用AFB1回收率的相对标准偏差的百分数表示（SD）。空白样品中分别加入50、100、

200 ng·mL-1 AFB1标准溶液，按照1.3.4的方法处理后，上机检测，重复5次。

（3）LOD与LOQ。最低检出限（LOD）由3倍信噪比（S/N=3/1）得出，最低定量限（LOQ）由10倍信噪比得出（S/N=10/1）。

2 结果与讨论

2.1 液相色谱条件的选择

实验对比了Hypersil Gold-C18柱和Agilent TC-C18柱对AFB1的分离效果，结果发现Hypersil Gold-C18柱对AFB1的分离效果好于Agilent TC-C18柱，因此选择Hypersil Gold-C18色谱柱。影响LC-MS/MS检测方法灵敏度的因素除了目标物自身的性质外，还有流动相的组成。本研究比较了甲醇-水、乙腈-水的分离效果和离子化效率，结果发现甲醇与乙腈都能实现目标化合物的分离。在流动相中加入适量的乙酸铵和甲酸能够提高目标物的离子化效率，同时可以有效改善峰形[5]。在流动相中加入含0.1%甲酸的5 mmol·L-1乙酸铵、0.1%乙酸的5 mmol· L-1乙酸铵，结果发现加入含0.1%甲酸的5 mmol·L-1的乙酸铵，可以明显增加AFB1的响应值。因此，最终确定流动相为甲醇-水（含0.1%甲酸的5 mmol·L-1乙酸铵）。

2.2 质谱条件的选择

在正离子（ESI+）模式下对AFB1进行全扫描分析，结果发现AFB1在ESI+模式下生成[M+H]+离子团，因此本实验采用ESI+监测模式（表2）。AFB1的MRM图如图1。

2.3 提取条件的优化

2.3.1 提取时间的优化

在25 ℃下，加标量为20 μg·kg-1，选用乙腈/水（84/16）做为提取溶剂，改变提取时间（20、40、60、80 min及100 min），检测计算毒素的回收率。由图2可知，随着提取时间的增加，当提取时间为60 min时，AFB1毒素的回收率最高。因此，提取时间选为60 min时。

2.3.2 提取温度的优化

选用乙腈/水（84/16）為提取溶剂，提取时间选为60 min，加标量为20 μg·kg-1，改变提取温度（5、15、25、35 ℃及45 ℃），检测计算毒素的回收率。由图3可知，当提取温度为25 ℃时，AFB1的回收率达到最高。因此，提取温度选取25 ℃。

2.3.3 提取溶剂比例的优化

提取时间为60 min，提取温度为25 ℃，加标量为20 μg·kg-1，选用乙腈-水为提取溶剂，改变溶剂比例（76/24，80/20，84/16，88/12及92/8），检测并计算毒素的回收率。结果发现：随着乙腈比例的增加，AFB1毒素的回收率先上升后下降;当乙腈/水为84/16时，AFB1的回收率明显提高（图4）。因此，溶剂比例选为84/16。

2.4 方法学验证

2.4.1 线性和检测下限

吸取适量的标准溶液，加入空白样品中，使空白样品加标量为0、0.5、1、10、50 ng·g-1及100 ng·g-1，参照1.3.4方法进行前处理后上机测定。以AFB1浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。结果发现，线性相关系数R2为0.999 86，线性范围良好，虾干中AFB1的LOD值为0.1 μg·kg-1，LOQ值为0.5 μg·kg-1。

2.4.2 回收率和精密度

在空白样品中分别添加浓度为1、50、100 μg·kg-1的AFB1标准溶液。平行测定5次，计算各毒素的回收率和精密度。结果发现AFB1的回收率在84.36%～103.27%。

AFB1的相对标准偏差在1.46%～8.03%。表明本方法用于虾干中AFB1的提取具有良好的准确度和精密度，符合实验需求。

3 结论

通过对前处理方法及色谱、质谱条件的优化建立了虾干中AFB1的LC-MS检测方法。选用甲醇-水（含0.1%甲酸的5 mmol·L-1乙酸铵）为流动相，ESI+扫描模式，乙腈/水（84/16）为提取溶液，提取时间60 min，提取温度25 ℃，正己烷脱脂净化。该条件下建立的虾干中AFB1毒素检测方法快速、准确、灵敏度高。

参考文献：

[1]伏春燕.玉米中三种真菌毒素检测方法旳研究[D].泰安：山东农业大学，2014.

[2]莫新少.黄曲霉毒素B1暴露及控制的研究进展[J].护士进修杂志，2009，24（1）：32-34.

[3]Wang X C，Liu X D，Liu J C，et al. Contamination Level of T-2 and HT-2 Toxin in Cereal Crops fromAba Area in Sichuan Province， China[J]. Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology， 2012，88（3）：396-400.

[4]王小博，施 琦，王雅玲，等.高效液相色谱-串联质谱法测定3种水产品中的T-2毒素与HT-2毒素[J].食品科学，2016，37（24）：164-169.

[5]韩 深，刘 萤，王佩葫，等.超高效液相色谱串联四极杆质谱法快速测定葡萄酒中8种真菌毒素[J].环境化学，2013，32（7）：1417-1421.