金耳菌种生产技术研究

刘书畅，李荣春**，马布平，罗祥英，李梦杰，曹 瑶，闻邵峰，周忠发，杨林雷

（1.云南农业大学食用菌研究所，云南 昆明 650201；2.云南菌视界生物科技有限公司，云南 昆明 650100）

金耳（Tremella aurantialbaBandoin et Zang），又名金木耳、黄耳、金银耳、黄金银耳、黄木耳、脑耳、脑形银耳，在分类学上隶属于菌物界（Fungi）担子菌门 （Basidiomycota） 银耳纲 （Tremellomycetes） 银耳目 （Tremellales） 银耳科 （Tremellaceae） 银耳属（Tremella）[1-3]。金耳主要分布于欧洲、亚洲、南北美洲和大洋洲，属于世界分布型真菌，但其种源却很少。通过金耳菌种生产工艺研究，提高菌种活力、抗杂能力等，对提高金耳生物学效率，缩短生长周期等具有重要意义[4-6]。

国内外学者对金耳的研究除了生物学特性、资源分布、营养物质的测定[7-8]，主要集中在深层发酵等方面，如邓超等[9-12]对金耳发酵液多糖的成分与作用的相关研究。近年来云南农业大学食用菌研究所对金耳菌生物学特性、资源分布、优良菌株优化筛选、栽培技术、营养物质测定等方面进行深入研究，为金耳菌种生产工艺的研究奠定了坚实的基础[13]。

1974年～1977年福建省三明真菌研究所黄年来等[14]对金耳生活条件、菌种分离与制作、段木栽培试验成功；1982年后，金耳人工栽培开始大面积示范推广，在金耳人工栽培的几十年间，因生产菌种不同性状带来的生物学效率低、生长周期长等问题明显，本次试验通过对菌种生产技术的研究，以获得较为理想的菌种及配套生产技术[15-19]。

1 材料与方法

1.1 材料

试验菌株CYJ和试验所需材料由云南菌视界生物科技有限公司提供。

1.2 试验方法

1.2.1 母种碳源、氮源筛选

1） 母种碳源筛选

基础培养基（CK）：蛋白胨 3 g、琼脂 18 g、KH2PO43.0 g、MgSO41.5 g，水1 000 mL，pH自然。分别将不同的碳源称取20 g加入基础培养基中，配方见表1。常规制作，接种后置于20℃恒温培养箱进行暗培养，第3天开始划线，每天同一时间记录菌丝、子实体的生长情况，测量菌丝生长速度，5次重复，使用EXCEL、SPSS20.0软件对数据进行平均数处理并分析。

表1 不同碳源培养基配方

2） 母种氮源筛选

基础培养基（CK）：葡萄糖20 g、琼脂18 g、KH2PO43.0 g、MgSO41.5 g，水1 000 mL，pH自然。将不同的氮源分别称取3 g加入基础培养基中，配方见表2。常规制作，接种后置于20℃恒温培养箱进行暗培养，记录分析方法同母种碳源筛选试验的方法。

表2 不同氮源培养基配方

3）母种碳氮源组合筛选

综合PDA培养基（CK）：马铃薯200 g、葡萄糖 20 g、蛋白胨 3 g、琼脂 18 g、KH2PO43.0 g、MgSO41.5 g，水1 000 mL，pH自然；基础培养基：琼脂 18 g、KH2PO43.0 g、MgSO41.5 g，水 1 000 mL，pH自然。具体配方见表3。常规制作，接种后置于20℃恒温培养箱进行暗培养，记录分析方法同母种碳源筛选试验的方法。

表3 不同组合碳氮源配方

1.2.2 原种配方筛选试验

本试验设计5种培养基配方[20-24]，即配方1：木屑87%、玉米粉11%、蔗糖1%、石膏1%；配方2：木屑75%、玉米粉10%、麦麸13%、蔗糖1%、石膏1%；配方3：木屑74%、麦麸24%、蔗糖1%、石膏1%；配方4：木屑64%、麦麸24%、玉米粉10%、蔗糖1%、石膏1%；配方5：木屑52%、棉籽壳23%、麦麸23%、蔗糖1%、石膏1%。

常规装瓶灭菌后在18℃培养条件下暗培养，观察记录菌丝、子实体生长情况，菌种生长周期，测量菌丝生长速度，使用EXCEL、SPSS 20.0软件对数据进行平均数处理并分析。

1.2.3 培养基碳氮比筛选试验

最适配方为基础培养基，计算其碳氮比，设置碳氮比梯度：490∶1、440∶1、390∶1、340∶1、290∶1、240∶1。计算对应配方，装料灭菌，接种后在18℃培养条件下暗培养，数据记录、分析方法同1.2.2，筛选出最适的碳氮比。

1.2.4 原种pH筛选试验

按照碳氮比为390∶1的培养料配方为木屑91.4%、玉米粉6.6%、石膏1%、糖1%，含水量58%，培养温度18℃。设置pH梯度为5、5.5、6、6.5、7，称取好培养料之后，使用0.1 mol·L-1的NaOH、HCl试剂调节培养料pH，PHS-2C型酸度计测定。常规灭菌，接种培养，数据记录、分析方法同1.2.2。

1.2.5 原种培养温度试验

1） 恒温试验

培养料配方同1.2.4，含水量58%，在最适pH前提条件下，设置恒温培养温度梯度为14℃、16℃、18℃、20℃、22℃、24℃、26℃、28℃，接种后在不同温度梯度下培养，记录、分析方法同1.2.2。

2） 变温试验

培养料配方同1.2.4，含水量58%，在最适pH前提条件下，首先在22℃的条件下培养，在培养不同天数后转移到18℃的培养箱中培养，以达到变温培养的效果，变温时间梯度为3 d、6 d、9 d、12 d、15 d、18 d、21 d、24 d。记录分析方法同1.2.2。

1.2.6 不同性状菌种出菇试验

在菌种培育过程中，菌种会呈现带黄水、被革菌包裹、子实体“自溶”等现象，即设置带黄水、被革菌包裹、子实体“自溶”与正常的4种性状的菌种进行出菇比较。4种不同性状菌种分别接种到培养革菌菌丝35 d的栽培袋中，在20℃条件下培养，通过记录分析子实体长势、定植率、出菇率、生长周期、计算生物学效率得到最佳菌种。

2 结果分析

2.1 不同碳源、氮源对金耳菌生长的影响

2.1.1 不同碳源对金耳菌生长的影响

不同碳源对金耳菌生长影响情况见表4。

表4 不同碳源对金耳菌生长影响情况

由表4可知，金耳菌能较好吸收多种碳源，无碳源时不能生长，添加碳源使菌丝、子实体长势不同程度变好、生长速度加快；其中果糖为碳源时菌丝生长速度最快、葡萄糖次之，分别为0.36 cm·d-1、0.35 cm·d-1；半乳糖为碳源时子实体长势旺，菌丝长势较好，生长周期较短。综合金耳混合菌丝长势、子实体生长势及其生长周期，半乳糖为本次试验最好的碳源，果糖、麦芽糖次之，糊精不利于金耳生长。

2.1.2 不同氮源对金耳生长的影响

在不同氮源培养基中，金耳混合菌丝的生长速度大多呈显著或极显著差异。酵母膏为氮源时金耳混合菌丝生长速度最快，为0.531 cm·d-1；硝酸钾时为氮源时菌丝生长最慢，为0.217 cm·d-1；无氮源的培养基中金耳混合菌丝的生长速度较慢，为0.33 cm·d-1；尿素为氮源的培养基会抑制金耳混合菌丝、子实体的生长。金耳菌可较好吸收酒石酸铵、氯化铵、酵母膏，不能较好吸收尿素、牛肉膏、硫酸铵。综合金耳混合菌丝、子实体长势，生长周期，酵母膏、氯化铵、酒石酸铵作碳源时金耳子实体长势较好，在生产菌种时皆可采用，酒石酸铵为最佳氮源。

2.1.3 不同碳源、氮源组合对金耳生长的影响

不同组合碳源对金耳生长的影响情况见表5。

表5 不同组合碳源对金耳生长的影响情况

表5试验结果表明，3种优质碳源、氮源营养添加剂相互组合培养金耳菌，金耳混合菌丝生长速度少数呈显著或极显著差异。酵母膏与半乳糖组合时菌丝生长速度快，为0.405 cm·d-1，菌丝长势旺盛、粗壮，但子实体膨大不明显、长势弱，菌种易老化。氯化铵与半乳糖、酒石酸铵与半乳糖组合时，菌丝、子实体长势旺盛，生长速度快，最佳组合为酒石酸铵与半乳糖，其他几种组合营养剂添加时，菌丝长势、子实体长势无明显差异，均适宜金耳菌的生长。

2.2 原种配方筛选试验

菌株在5种培养基中的生长情况见表6。

由表6可知，原种培养基配方1与其他4种培养基中金耳混合菌丝的生长速度呈极显著差异，且

表6 菌株在5种培养基中的生长情况

2.3 原种培养基质碳氮比筛选试验

不同碳氮比培养基对金耳菌的生长影响情况见表7。

表7 不同碳氮比培养基对金耳菌的生长影响情况

图1 金耳在不同碳氮比培养基中的生长情况

由表7、图1可知，金耳混合菌丝在不同碳氮比培养基其中生长速度呈显著差异，混合菌丝在碳氮比为390:1的培养基生长最快，490:1时生长最慢。氮源的增加使菌丝更加浓密、旺盛，子实体长势较好，周期缩短，但成耳率降低。综合考虑菌丝、子实体生长势及生长周期，生产时配方碳氮比为390:1较适宜，即对应的配方为：木屑91.4%、玉米粉6.6%、石膏1%、糖1%。

2.4 pH对金耳菌生长的影响

不同pH对金耳菌生长的影响情况见表8。

表8 不同pH对金耳菌生长的影响

由表8可知，培养料中pH呈梯度增加时，菌丝生长速度呈显著性或极显著性差异，pH为6.5时金耳混合菌丝生长最快、长势一般，子实体长势旺盛、成耳率高、生长周期短。培养料中pH为6.5时，pH增大或减小，菌丝、子实体的生长情况都会变差，成耳率降低、生长周期变长。即，金耳生长所需的最适酸碱度范围为5.5～6.5，最佳的pH为6.5，严格控制灭菌条件、接种时间，减小其他因素的影响。

2.5 温度对金耳菌生长的影响

2.5.1 不同恒定温度对金耳菌生长的影响

不同温度培养条件下，金耳混合菌丝生长速度呈显著性或极显著性差异。22℃时，菌丝生长速度最快，14℃时，菌丝生长速度最慢；供试培养温度范围内，培养温度在14℃～22℃时，菌丝生长速率随温度的升高而加快；温度在22℃～28℃时，菌丝生长速率随温度的升高而减小；子实体在20℃时长势最强，在此基础上，温度升高或降低都会抑制子实体生长。综合考虑几种因素，最适宜的培养温度范围为18℃～22℃。

2.5.2 变温处理对金耳菌生长的影响

试验表明，变温时间短，金耳成耳率高、周期长；变温时间长，金耳成耳率低、周期短。金耳混合菌丝在22℃培养条件下，菌丝生长速度较快，12 d后菌丝长满瓶，变温时间为9 d时，成耳率最高。综合考虑几个因素，最适变温时间为3 d～9 d。在生产过程中，依据生产条件、经济效益，适当调整金耳变温时间，变温时间为9 d比较适宜，此处理成耳率高，生长周期较短。

2.6 不同性状菌种出菇效果

不同性状菌种出菇情况见表9。

表9 不同性状菌种出菇情况

由表9可知，正常菌种接种后出菇培养，定植率、出菇率、生物学效率最高，革菌包裹菌种次之，其他2种较低；出菇率在定植率的基础上相应降低，生长周期无显著差异；正常菌种出菇质量较好，生物学效率高达44%，革菌包裹菌种、带黄水菌种、自溶菌种的生物学效率依次为32%、23%、15%。

标准菌种的出菇效果最好，转色一致、朵型大小相似、出菇整齐。带黄水菌种有革菌包裹、携带黄水等问题，接种后的子实体易污染、膨大困难。“自溶菌种”开裂部分不易膨大或膨大速度慢、易污染、出菇不整齐等问题严重。

3 讨论

本试验得到的最佳碳源、氮源分别为半乳糖、酒石酸铵，并将2种最佳碳氮源进行组合优化，得到最佳碳源、氮源组合为半乳糖+酒石酸铵，这与赵永昌等[25]在金耳最佳碳源、氮源方面研究的结果有所出入，可能是试验菌株、碳源和氮源筛选的方法不同而形成的差异。试验配方的筛选是在刘正南[15]等的研究基础上，以找到金耳菌适宜生长的培养基质为目的，结合试验材料的实用、经济等因素选择5种配方进行筛选后优化，得到最佳配方为木屑91.4%、玉米粉6.6%、石膏1%、糖1%。通过pH、温度。试验结果表明，金耳生长适宜的pH范围为5.5～6.5，恒温培养温度为18℃～22℃，与吴锡鹏[26]等在金耳栽培技术中的研究结果相似，目前金耳生产的菌种有被革菌包裹、带黄水、“自溶”等较典型的情况，通过与“标准菌种”进行出菇比较，更加深刻的了解到问题菌种与优质菌种的差异，同时体现了优质菌种的重要性。

金耳子实体是金耳菌丝与毛韧革菌菌丝的复合体，需要的生长条件较为复杂，试验考虑到此因素，通过变温培养金耳菌；变温过程是先经过较高温度培养一段时间后，再进行较低温度培养；采取变温培养、先高温后低温的方法可有效考虑到金耳属于伴生菌，幼耳生长发育时菌丝过于旺盛会抑制子实体膨大，同时出现黄水、“自溶”等问题。

本次试验主要集中在菌种的营养需求、培养条件的筛选上，对于培育优质菌种只做了部分工作，在金耳菌优良菌株、适宜容器、接种工艺、出菇管理等多方面需要进行深入研究，才能培育出更加优质的金耳菌种。