金橘药材的UPLC指纹图谱建立、聚类分析及主成分分析

黄华花 王明军 黄鸣清 吕诗诗 王圣江

摘 要 目的：建立金橘药材的超高效液相色谱（UPLC）指纹图谱，并进行聚类分析和主成分分析。方法：采用UPLC法，色谱柱为Waters Acquity UPLC BEH C18，流动相为乙腈-0.1%磷酸水溶液（梯度洗脱），流速为0.3 mL/min，检测波长为330 nm，进样量为2 μL。以金柑苷峰为参照，绘制8批药材样品的UPLC指纹图谱；采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2012 版）进行相似度评价，确定共有峰；采用SPSS 24.0软件对8批药材样品进行聚类分析和主成分分析。结果：8批药材样品的UPLC指纹图谱有24个共有峰，相似度均大于0.97。聚类分析结果显示，8批药材样品可聚为两类，S1～S4、S6～S8聚为一类，S5聚为一类。经主成分分析，3个主成分因子的累计方差贡献率为81.366%。结论：所建UPLC指纹图谱及聚类分析和主成分分析结果可为金橘药材的质量控制提供参考。

关键词 金橘；超高效液相色谱法；指纹图谱；相似度评价；聚类分析；主成分分析

Establishment of UPLC Fingerprint， Cluster Analysis and Principal Component Analysis of Fortunella margarita

HUANG Huahua1，WANG Mingjun1，HUANG Mingqing2，LYU Shishi1，WANG Shengjiang1（1. Dept. of Pharmacy， Xiamen Medical College/Fujian Provincial Key Lab of Traditional Chinese Medicine/Fujian Provincial Key Lab of Traditional Chinese Medicine Finish Processing and Health Product Development， Fujian Xiamen 361023， China； 2. College of Pharmacy， Fujian University of TCM， Fuzhou 350122， China）

ABSTRACT OBJECTIVE： To establish UPLC fingerprint of Fortunella margarita， and to conduct its cluster analysis and principal component analysis. METHODS： UPLC method was adopted. The determination was performed on Waters Acquity UPLC BEH C18 column with mobile phase consisted of acetonitrile-0.1% phosphoric acid solution （gradient elution） at the flow rate of 0.3 mL/min. The detection wavelength was set at 330 nm， and sample size was 2 μL. Using fortunellin as reference， UPLC fingerprints of 8 batches of F. margarita were determined. The similarity of 8 batches of samples was evaluated by TCM Chromatographic Fingerprint Similarity Evaluation System（2012 edition） to confirm common peak. Cluster analysis and principal component analysis were performed by using SPSS 24.0 software. RESULTS： There were 24 common peaks in UPLC fingerprints of 8 batches of sample，the similarity of which was higher than 0.97. Cluster analysis showed that 8 batches of samples were clustered into 2 categories. S1， S2， S3， S4， S6， S7 and S8 were clustered into one category； S5 was clustered into the other category. By principal component analysis， the accumulative contribution rate of three main components was 81.366%. CONCLUSIONS： Established UPLC fingerprint， the results of cluster analysis and principal component analysis can provide reference for quality control of F. margarita.

KEYWORDS Fortunella margarita； UPLC； Fingerprint； Similarity evaluation； Cluster analysis； Principal component analysis

金橘，别名金桔、山橘、金枣、金柑、金弹等，是芸香科植物金橘[Fortunella margarita（Lour.）Swingle]的果实，原产于我国，其中福建尤溪、广西融安、广西陽朔、江西遂川、湖南浏阳和浙江宁波是金橘的六大产区[1]。金橘药食同源，是一种营养价值较高的水果，同时也具有较高的药用价值[2]。《中华本草》记载，金橘性温，味辛、甘，具有理气解郁、消食化痰、醒酒之功效，主治胸闷郁结、脘腹痞胀、食滞纳呆、咳嗽痰多、伤酒口渴[3]。现代研究表明，金橘具有抑菌、抗氧化、调节免疫等作用[4-5]；除可直接食用或泡水饮用外，市面上还有咸金枣、金枣丹、金桔咀嚼片等相关制剂[6-7]。目前，金橘药用方面的研究主要集中在成分分离和药理活性方面[8-10]，未见质量控制方面的报道及相关质量标准。金橘药材中许多成分的对照品在市面上购买不到，目前仅有金柑苷对照品和野漆树苷对照品，但仅对一两个成分进行含量测定并不能有效控制金橘药材的整体质量。为此，本研究收集了我国主要产地的金橘药材样品，建立了其超高效液相色谱（UPLC）指纹图谱，并结合聚类分析和主成分分析进行综合质量评价，旨在为有效控制其质量提供参考。

1 材料

1.1 仪器

Acquity型 UPLC仪，包括四元高压梯度泵、真空脱气机、自动进样器、二极管阵列检测器、Empower? 3色谱工作站（美国Waters公司）；BS224S型电子天平（德国Sartorius公司）；KQ5200E型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 试剂

金柑苷对照品（上海源叶生物科技有限公司，批号：Q14M10Q73839，纯度：>98%）；乙腈（色谱纯，美国Tedia公司）；甲醇、磷酸等其他试剂均为分析纯，水为超纯水。

1.3 药材

金橘（编号：S1～S8）经厦门医学院药学系鲍红娟副教授鉴定为金橘[Fortunella margarita （Lour.） Swingle]的果实。药材样品来源见表1。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Waters Acquity UPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 ?m）；流动相：乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脱（0～20 min，5%A→40%A；20～25 min，5%A）；流速：0.3 mL/min；检测波长：330 nm；进样量：2 μL。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液 取金柑苷对照品适量，精密称定，加75%甲醇溶解，制成质量浓度为24.6 μg/mL的对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液 取药材样品适量，粉碎，过40目筛，取0.5 g，精密称定，置于具塞三角瓶中，加75%甲醇25 mL，称定质量，超声（功率：900 W，频率：40 kHz）处理30 min，放冷，再次称定质量，用75%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.3 方法学考察

2.3.1 精密度试验 取“2.2.2”项下供试品溶液（编号：S4）适量，按“2.1”项下色谱条件连续进样测定6次，以金柑苷峰的保留时间和峰面积为参照，记录各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果，24个共有峰相对保留时间的RSD均小于0.10%（n=6），相对峰面积的RSD均小于1.92%（n=6），表明本方法精密度良好。

2.3.2 稳定性试验 取“2.2.2”项下供试品溶液（编号：S4）适量，分别于室温下放置0、2、4、8、10、12、24 h时按“2.1”项下色谱条件进样测定，以金柑苷峰的保留时间和峰面积为参照，记录各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果，24个共有峰相对保留时间的RSD均小于0.28%（n=7），相对峰面积的RSD均小于2.84%（n=7），表明供试品溶液于室温下放置24 h内稳定性良好。

2.3.3 重复性试验 取药材样品（编号：S4）0.5 g，共6份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，以金柑苷峰的保留时间和峰面积为参照，记录各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果，24个共有峰相对保留时间的RSD均小于0.15%（n=6），相对峰面积的RSD均小于2.90%（n=6），表明本方法重复性良好。

2.4 UPLC指纹图谱的生成与相似度、共有峰相关分析

2.4.1 UPLC指纹图谱的生成 取8批药材样品适量，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2012版）对8批药材样品指纹图谱进行分析，得UPLC指纹图谱，详见图1、图2。

2.4.2 相似度评价 采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2012版），以药材样品的UPLC对照指纹图谱为对照，进行整体相似度评价。结果显示，8批药材样品的相似度均大于0.97，提示药材样品的化学成分一致性较好，详见表2。

2.4.3 共有峰的指认及相关分析 8批药材样品共有24个共有峰，通过与对照品溶液的UPLC图（见图3）比对，指认23号峰为金柑苷峰。因该峰分离度良好、峰面积大且稳定，故以其保留时间和峰面积为参照，计算其他峰的相对保留时间和相对峰面积，详见表3、表4。

2.5 聚类分析

以各共有峰的峰面积除以称样量的数值作为原始数据，采用SPSS 24.0软件，以组间联接法结合平方欧氏距离对8批药材样品进行聚类分析，详见图4。由图4可知，8批药材样品可聚为两类，S1～S4、S6～S8聚为一类，S5聚为一类。

2.6 主成分分析

对8批药材样品的24个共有峰的绝对峰面积进行标准化处理后，采用SPSS 24.0软件进行主成分分析，其特征值和方差贡献率结果见表5。由表5可知，共得到3个主成分因子，特征值分别为10.736、6.067、2.725，方差贡献率分别为44.732%、25.280%、11.353%，累计方差贡献率为81.366%。这提示，主成分因子1、2、3可作为金橘药材的评价指标，适用于主成分分析。故取主成分因子1、2、3为指标对8批药材样品进行评价，详见表6、图5。结果显示，8批药材样品中S1～S4、S6～S8样品质量较为相近，与S5质量差异较大。

3 讨论

现代研究表明，金橘具有抗炎镇痛、镇咳祛痰、免疫调节、预防结石、解酒保肝等作用[11-14]，其主要有效成分为黄酮类成分[12，15]。也有研究發现，金橘中所含的黄酮类成分包括金柑苷、柚皮素、根皮苷、野漆树苷、4′-甲氧基-牡荆素-2″-O-α-L-鼠李糖苷、4′-甲氧基-异牡荆素- 2″-O-α-L-鼠李糖苷、芦丁等[16-18]。笔者参考上述文献，发现金柑苷为金橘的特征性成分之一，因此选择金柑苷作为参照峰建立金橘药材的UPLC指纹图谱。

本试验比较了乙腈-水、甲醇-水的流动相体系，发现两种体系中各组分分离度均较好，但采用乙腈-水流动相体系时出峰较快，因此初步选出乙腈-水为流动相体系。但试验过程中发现，检测一段时间后，色谱峰出现了拖尾现象，而再加入0.1%磷酸可使峰形改善且稳定，故最终确定乙腈-0.1%磷酸水溶液为流动相。笔者又比较了267、330 nm波长下样品的色谱行为，发现在330 nm波长下基线较平稳，色谱峰较多，各峰的峰高合适，故选择330 nm为检测波长。

采用50%、75%、100%甲醇分别对样品进行提取时，发现得到的色谱峰及各峰面积差异不大，但50%甲醇提取时的样品溶液滤过困难，又考虑到环保因素，最终选择75%甲醇为提取溶剂。同时，笔者又考察了不同提取时间（15、30、45 min）对提取效果的影响，结果发现，提取30 min时的提取效果较提取15 min好，提取45 min时与提取30 min无显著差异，故选择提取时间为30 min。

相似度评价结果显示，8批药材样品的相似度均大于0.97，表明药材样品的化学成分一致性较好；8批样品24个共有峰的相对保留时间的RSD范围为0～0.31%，相对峰面积的RSD范围为0～66.36%，表明不同产地间药材样品虽具有相同的化学成分，但含量存在差异。聚类分析、主成分分析结果均显示，8批药材样品可聚为两类，S1～S4、S6～S8聚为一类，S5聚为一类，表明8批药材样品中S1～S4、S6～S8样品质量较为相近，与S5质量差异较大。该结果与相似度评价结果一致，其原因可能与药材的产地、采集时间、植株生长年份不同有关。

综上所述，本研究所建UPLC指纹图谱及聚类分析和主成分分析结果可为金橘药材的质量控制提供参考。

参考文献

[ 1 ] 郑洁，江东，张耀海，等.我国主要金柑品种果皮中挥发性成分比较[J].食品科学，2015，36（6）：145-150.

[ 2 ] 李丽，盛金凤，孙健，等.金桔的营养价值及综合利用现状与前景[J].食品工业，2015，36（9）：220-224.

[ 3 ] 国家中医药管理局《中华本草》编委会.中华本草：第四卷[M].上海：上海科学技术出版社，1999：936.

[ 4 ] 项娟娟.金桔胶囊抗炎镇痛、镇咳祛痰和免疫增强的药理学作用[J].中国药房，2014，25（11）：1003-1005.

[ 5 ] 黎继烈，崔培梧，吴耀辉，等.金橘黄酮对小鼠抗氧化作用的研究[J].时珍国医国药，2009，20（5）：1031-1032.

[ 6 ] 郑正男，丁利君，郑希，等.梅子风味金枣丹的加工工艺技术研究[J].食品工业，2016，37（1）：160-163.

[ 7 ] 零东宁，何雪梅，孙健，等.金桔咀嚼片加工工艺的研究[J].轻工科技，2015（8）：12-13.

[ 8 ] 孟猛.金柑柠檬苦素类化合物的提取纯化、结构鉴定及生物活性研究[D].福州：福建农业大学，2013.

[ 9 ] 陈萍，娄东华，王建刚.金橘挥发性成分的SPME-GC/MS分析[J].食品研究与开发，2011，32（12）：140-142.

[10] 刘顺珍，刘红星，张丽霞，等.金橘叶和金橘果皮挥发油成分的分析[J].安徽农业科学，2011，36（26）：15968-15972.

[11] 白婕.金橘化学成分及抗氧化作用初步研究[D].长沙：中南林业科技大学，2007.

[12] 黎继烈，王卫，刘忠敏，等.金橘黄酮对小鼠免疫功能的影响[J].时珍国医国药，2009，20（7）：1599-1600.

[13] 余志运，石洪波，张雪军，等.金桔液预防草酸钙肾结石的实验与临床研究[J].临床泌尿外科杂志，2005，20（9）：543-545.

[14] 陈则夷.金柑解酒保肝组分功效研究[D].长沙：湖南农业大学，2012.

[15] 唐巧玉，周毅峰，朱玉昌，等.金橘皮中黄酮类物质的提取及其体外抗氧化活性研究[J].农业工程學报，2008，24（6）：258-261.

[16] 田圣梅.蕨菜和金橘果实化学成分的研究[D].合肥：安徽大学，2011.

[17] 葛永斌.金橘化学成分研究[J].中药材，2014，37（3）：435-438.

[18] 王治元，李宁，王开金，等.金橘果皮的化学成分[J].植物资源与环境学报，2010，19（1）：92-94.

（收稿日期：2019-01-10 修回日期：2019-04-23）

（编辑：陈 宏）