双参饮对肝纤维化模型大鼠的改善作用及机制研究

黄祎 周刚 钟珊 周智 扈晓宇

摘 要 目的：研究双参饮对肝纤维化模型大鼠的肝功能和肝纤维化程度的改善作用及其机制。方法：取健康SD大鼠，以含40%四氯化碳的橄榄油溶液连续7周腹腔注射，建立肝纤维化模型。将造模成功的47只大鼠随机分为模型组、阳性对照组和双参饮低、中、高剂量组，各组分别为9、9、9、10、10只；另取10只健康SD大鼠作为正常组。从造模结束后次周開始，模型组与正常组大鼠灌胃水，阳性对照组[秋水仙碱0.2 mg/（kg·d）]和双参饮各剂量组[双参饮水煎液3、6、12 g/（kg·d），以总生药量计算]大鼠分别灌胃相应药液，连续给药28 d。采用赖氏分析法检测血清中肝功能指标[丙氨酸转氨酶（ALT）、天冬氨酸转氨酶（AST）、总胆红素（TBIL）、白蛋白（ALB）、球蛋白（GLB）]水平，采用酶联免疫吸附法检测血清中肝纤维化指标[透明质酸（HA）、层粘连蛋白（LN）、Ⅲ型胶原（Ⅲ-PC）、Ⅳ型胶原前体（Ⅳ-C）]水平；采用苏木精-伊红染色法和苦味酸酸性复红染色法观察大鼠肝组织病理学变化；采用分光光度法检测大鼠肝组织中超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、羟脯氨酸（HYP）水平；采用免疫组化法检测大鼠肝组织中α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）表达水平。结果：与正常组比较，模型组大鼠血清中ALT、AST、TBIL、HA、LN、PC-Ⅲ、Ⅳ-C水平均显著升高，ALB水平显著降低（P<0.05）；大鼠肝组织出现空泡变性、纤维组织增生等病理现象；肝组织中SOD水平显著降低，MDA、HYP水平均显著升高（P<0.05）；肝组织中可见大量α-SMA蛋白阳性染色颗粒，其蛋白表达水平显著升高（P<0.05）。与模型组比较，双参饮各剂量组大鼠血清中ALT、AST和肝纤维化指标水平均显著降低，ALB水平显著升高，双参饮中、高剂量组TBIL水平均显著降低（P<0.05）；肝细胞变性、纤维化组织增生现象均有较大改善；肝组织中SOD水平显著升高，MDA、HYP水平均显著降低（P<0.05）；α-SMA蛋白阳性染色明显减少，其蛋白表达水平显著降低（P<0.05）。结论：双参饮对肝纤维化模型大鼠有保肝、抗肝纤维化的作用，其机制可能主要是通过增强机体抗氧化能力、下调α-SMA蛋白表达、抑制肝星状细胞的活化、减少细胞外间质的合成，从而逆转肝纤维化进程。

关键词 双参饮；丹参；人参；肝纤维化；机制；大鼠

Study on Improvement Effect and Mechanism of Shuangshen Yin on Liver Fibrosis Model Rats

HUANG Yi1，ZHOU Gang2，ZHONG Shan3，ZHOU Zhi3，HU Xiaoyu1（1. Chengdu University of TCM， Chengdu 610075，China； 2. Bazhong Traditional Chinese Medicine Hospital， Sichuan Bazhong 636600， China； 3. Dept. of Infectious Disease，the Second Affiliated Hospital of Chongqing Medical University， Chongqing 400010， China）

ABSTRACT OBJECTIVE： To study improvement effect and mechanism of Shuangshen yin on liver function and the degree of liver fibrosis in liver fibrosis model rats. METHODS： Healthy SD rats were collected and given 40% CCl4 olive oil solution intraperitoneally for consecutive 7 weeks to induce liver fibrosis model. 47 model rats were randomly divided into model group， positive control group and Shuangshen yin low-dose， medium-dose and high-dose groups， with 9， 9， 9， 10， 10 rats respectively； another 10 healthy SD rats were included in normal group. From the next week after model induction， model group and normal group were given water intragastrically； positive control group [colchicines 0.2 mg/（kg·d）] and Shuangshenyin groups [Shuangshen yin water decoction 3， 6， 12 g/（kg·d）， by crude drug] were given corresponding medicines respectively for consecutive 28 d. The serum levels of liver function indicators （ALT， AST， TBIL， ALB， GLB） were determined by Ryes analysis method. The serum levels of liver fibrosis indexes （HA， LN， Ⅲ-PC， Ⅳ-C） were determined by ELISA. The pathological changes of liver tissues were observed by HE staining and VG staining. The levels of SOD， MDA and HYP in liver tissues were determined by spectrophotometry. The expression of α-SMA was detected by immunohistochemistry. RESULTS： Compared with normal group， the serum levels of ALT， AST， TBIL， HA， LN， PC-Ⅲ and Ⅳ-C in model group were increased significantly， and the level of ALB was decreased significantly （P<0.05）. There were some pathological phenomena such as vacuolar degeneration and fibrous tissue proliferation in rat liver. The levels of SOD in liver tissue were decreased significantly， while the levels of MDA and HYP were increased significantly （P<0.05）. A large number of positive staining granules of α-SMA protein were observed in liver tissue， and the expression level of α-SMA protein was significantly increased （P<0.05）. Comparison of model group， the serum levels of ALT， AST and liver fibrosis indexes were significantly decreased and ALB level was significantly increased in Shuangshen yin groups， while the TBIL levels in Shuangshen yin medium-dose， high-dose groups were significantly decreased （P<0.05）； the phenomena of hepatocyte degeneration and fibrosis tissue proliferation were significantly improved； the levels of SOD in liver tissue were significantly increased， and the levels of MDA and HYP were significantly decreased （P<0.05）； the positive staining of α-SMA protein decreased significantly， and the expression level of α-SMA protein was decreased significantly （P<0.05）. CONCLUSIONS： Shuangshen yin has protective and anti-fibrotic effects on liver in rats with hepatic fibrosis， the mechanism of which may be associated with enhancing antioxidant capacity， down-regulating the expression of α-SMA， inhibiting the activation of hepatic stellate cells， reducing extracellular matrix synthesis so as to reverse liver fibrosis.

2.3 大鼠肝脏组织病理学观察

各组大鼠取肝相同部位组织，在10%的甲醛中固定24 h，脱水，石蜡包埋，切片（厚度：6 μm），进行HE或VG染色，在显微镜下观察肝细胞炎症程度及纖维化改变等情况。

2.4 大鼠肝组织中SOD、MDA、HYP水平检测

采用分光光度法检测。取“2.3”项下部分肝组织，按9倍质量比加入冰生理盐水碾磨制成组织匀浆，以3 000 r/min离心5 min，取上清液，按相应试剂盒说明书步骤操作，检测SOD、MDA、HYP水平。

2.5 大鼠肝组织中α-SMA蛋白表达水平检测

采用免疫组化法检测。取“2.3”项下制作的石蜡切片，脱蜡，抗原修复，滴加兔α-SMA多克隆抗体（1 ∶ 800）后，置于孵育盒中于4 ℃孵育18～24 h；PBS洗涤2 min×3次，按NovoLink聚合物检测系统RE7159试剂盒说明书操作步骤进行染色处理后，于显微镜下观察每个视野中阳性染色情况（即镜下呈棕褐色颗粒者）；同时，采用Image Pro Plus 6.0软件分析阳性染色部分的光密度值（OD），用来表示α-SMA蛋白表达水平。

2.6 统计学方法

采用SPSS 19.0统计软件对实验数据进行处理。计量资料以x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD检验。P<0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 大鼠肝功能指标水平

与正常组比较，模型组大鼠血清ALT、AST、TBIL水平均显著升高，ALB水平显著降低，差异均有统计学意义（P<0.05）；与模型组比较，阳性对照组和双参饮各剂量组大鼠ALT、AST水平均显著降低以及ALB水平显著升高，双参饮中、高剂量组TBIL水平均显著降低，差异均有统计学意义（P<0.05）；与阳性对照组比较，双参饮高剂量组大鼠血清ALT、AST、TBIL水平均显著减低，ALB水平显著升高，差异均有统计学意义（P<0.05）；各组大鼠血清GLB水平比较差异均无统计学意义（P>0.05）。各组大鼠肝功能指标水平检测结果见表1。

3.2 大鼠血清肝纤维化指标水平

与正常组比较，模型组大鼠血清HA、LN、PC-Ⅲ、Ⅳ-C水平均显著升高，差异均有统计学意义（P<0.05）；与模型组比较，阳性对照组和双参饮各剂量组大鼠上述血清肝纤维化指标水平均显著下降，差异均有统计学意义（P<0.05）；与阳性对照组比较，双参饮高剂量组大鼠上述血清肝纤维化指标水平均显著下降，差异均有统计学意义（P<0.05）。各组大鼠血清肝纤维化指标水平检测结果见表2。

3.3 大鼠肝组织病理学变化

镜下可见，经HE或VG染色后，正常组大鼠肝细胞整齐规则，中央静脉清晰可见，未见扩张与萎缩；模型组大鼠肝细胞排列紊乱、存在大量空泡变性，肝组织汇管区、中央静脉周围可见较多纤维组织增生，甚至形成假小叶，中央静脉萎缩或消失；阳性对照组大鼠肝组织有少量肝细胞水肿变性，汇管区、中央静脉周围可见部分纤维组织增生，肝细胞坏死及纤维组织增生现象较模型组均有不同程度减轻；双参饮各剂量组大鼠肝细胞变性、纤维化组织增生现象较模型组均有较大改善，且中、高剂量组病理学变化程度较阳性对照组明显减轻。各组大鼠肝组织病理学变化显微图见图1、图2。

3.4 大鼠肝组织中SOD、MDA、HYP水平

与正常组比较，模型组大鼠肝组织中SOD水平显著降低，MDA、HYP水平均显著升高，差异均有统计学意义（P<0.05）；与模型组比较，阳性对照组和双参饮各剂量组大鼠肝组织中SOD水平显著升高，MDA、HYP水平均显著降低，差异均有统计学意义（P<0.05）；与阳性对照组比较，双参饮中、高剂量组大鼠肝组织中SOD水平均显著升高，MDA水平均显著降低，差异均有统计学意义（P<0.05），其余指标水平差异无统计学意义（P>0.05）。各组大鼠肝组织中HYP、SOD、MDA水平检测结果见表3。

3.5 大鼠肝组织中α-SMA蛋白表达水平

镜下可见，正常组大鼠肝组织中仅有少量阳性染色颗粒；模型组大鼠肝组织中可见大量棕褐色阳性染色颗粒，且主要集中于纤维组织及临近部位，在汇管区、中央静脉可见，而在假小叶及紧邻的肝窦区则更加明显，提示有较多α-SMA蛋白表达；阳性对照组和双参饮各剂量组大鼠肝组织中棕褐色阳性染色颗粒较之模型组均有不同程度的减少。定量分析结果显示，与正常组比较，模型组大鼠肝组织中α-SMA蛋白表达水平显著升高，差异有统计学意义（P<0.05）；与模型组比较，阳性对照组和双参饮各剂量组大鼠肝组织中α-SMA蛋白表达水平显著降低，差异均有统计学意义（P<0.05）；与阳性对照组比较，双参饮高剂量组大鼠肝组织中α-SMA蛋白表达水平显著降低，差异有统计学意义（P<0.05）。各组大鼠肝组织中α-SMA蛋白表达显微图见图3，蛋白表达水平检测结果见表4。

4 讨论

双参饮源于扈晓宇教授治疗肝纤维化的基础方，由人参和丹参两味药材组成。扈教授认为，肝纤维化多起于先天不足，而又外受湿热疫毒之邪，正虚邪恋，邪毒留于体内，病久则滞则瘀，故本病的基本病机在于气虚血瘀，血瘀贯穿于整个病程的始终。据我国《别录》《神农本草经》《本草纲目》等医药古籍记载，丹参活血而不伤正；人参助丹参活血祛瘀之功，补气而不壅滞；两药相伍，可共同发挥益气扶正、活血化瘀的治疗作用。现代药理学研究也证实，人参皂苷Rg1能提高肝纤维化模型大鼠细胞外基质（ECM）中的降解酶水平，并可显著降低大鼠体内活性氧的含量[7]；人参皂苷czh-A-69能有效抑制肝星状细胞（HSC）的激活[8]；丹参主要是通过抑制新生血管活性并调节血管内皮细胞功能的途径发挥抗纤维化的作用[9]；丹参酮ⅡA能发挥抑制HSC活化的作用，其机制可能与减少枯否细胞分泌的细胞因子表达有关[10]。前期通过随机对照的方法，经103例慢性乙型肝炎肝纤维化患者临床试验结果证实，联用双参饮治疗能有效改善患者肝脏生化指标，减轻其肝纤维化程度，缓解其临床症状及体征[2]。

ALT、AST、TBIL的水平可较准确地反映肝组织损伤程度[11]；ALB的水平也可作为反映肝功能的灵敏指标，用于协助诊断肝脏疾病[12]。肝纤维化4项（HA、Ⅳ-C、LN、Ⅲ-PC）是ECM的主要成分，而ECM含量高低与肝纤维化程度呈正相关，因此这4项指标水平可用于评价肝纤维化的病变程度[13]。本研究结果显示，与模型组比较，双参饮各剂量组大鼠血清中ALT、AST和肝纤维化4项水平均显著降低，ALB水平均显著升高，而双参饮中、高剂量组TBIL水平显著降低；与阳性对照组比较，双参饮高剂量组大鼠血清ALT、AST、TBIL和肝纤维化4项水平均显著降低，ALB水平显著升高。这表明双参饮有保肝、抗肝纤维化的作用，且呈剂量依赖趋势。

肝组织中SOD、MDA水平与肝脏过氧化有关。其中，SOD下降的程度能直接反映肝损伤程度；MDA是脂质过氧化物，可反映机体脂质过氧化的程度，能间接反映肝细胞损伤的程度[14-15]；而HYP与肝脏纤维化有关，是评估肝脏纤维化程度的有效指标[16]。肝纤维化的形成机制主要是由多种损伤因素造成肝窦内的HSC发生活化和增殖，致使肝脏组织内ECM的过度生成、大于降解，从而引发肝小叶、界板区及汇管区的纤维增生，而α-SMA正是活化的HSC的特征标志物[17]。本研究结果显示，双参饮干预治療后，能减少模型大鼠弥漫性肝细胞中空泡变性的产生和纤维组织增生，延缓肝纤维化的进程；能显著下调大鼠肝组织中MDA、HYP水平，上调SOD水平，并下调α-SMA的蛋白表达。

综上，双参饮对肝纤维化大鼠有保肝、抗肝纤维化的作用，其机制可能主要是通过增强机体抗氧化能力、下调α-SMA蛋白表达、抑制HSC的活化、减少ECM的合成，从而逆转肝纤维化进程。但肝纤维化的发生、发展过程涉及的机制极其复杂，并受多种因素影响，本研究仅对双参饮改善肝纤维化的作用机制进行了初步研究，而该方其他可能的作用机制还有待进一步探讨。

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（收稿日期：2019-03-01 修回日期：2019-04-30）

（编辑：段思怡）