QF-PCR技术在胎儿常见染色体非整倍体快速诊断中的临床应用*

刘沃满，唐玉芬△，黎洛冰，聂俊玮，谭满胜

(茂名市妇幼保健院：1.遗传优生优育中心；2.产前诊断中心，广东茂名 525000)

染色体非整倍体异常是一种常见的染色体数目异常，其中以三体型和单体型最为常见。最常见的染色体数目异常包括21三体综合征、18三体综合征、13三体综合征、三倍体和性染色体数目异常，如Klinefelter综合征(47，XXY)、Jacobs综合征(47，XXX)、XYY综合征(47，XYY)和Turner综合征(45，X),约占产前诊断中有临床意义染色体异常的80%[1]。这些疾病在胎儿期常表现为宫内死胎、流产等。出生后临床可表现为不同程度的智力低下、生长发育迟缓、性发育不良和其他组织器官畸形等，患者多数生活上不能自理，这给家庭和社会带来沉重的经济和精神负担。染色体异常目前还没有有效的治疗方法，仅能通过产前筛查和产前诊断干预患儿的出生，提高新生儿的质量。染色体核型分析是目前诊断染色体数目和结构异常的金标准，但因为是对活细胞进行培养，对环境条件和人员的要求比较高，而且以手工操作为主，耗时长，造成孕妇及其家属等待核型分析结果的焦虑。荧光定量聚合酶链反应(QF-PCR)技术是近年发展的一种快速诊断染色体非整倍体的分子生物学方法，目前已广泛应用于国内外多家产前诊机构[2-7]。本研究是应用QF-PCR技术和核型分析两种方法对3 398例胎儿样本进行检测，并对结果进行比较分析，现将结果报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 87例绒毛、219例脐带血和3 092例羊水标本来自于2016年3月至2018年12月本院产前诊断中心就诊的3 398例高危孕妇，风险指标主要包括孕妇高龄、唐筛高风险、无创产前基因检测高风险、胎儿超声异常、夫妇双方患有珠蛋白生成障碍性贫血(简称地贫)、不良生育史和染色体异常家族史，孕周为7～25周。

1.2标本采集 孕妇在本院产前诊断中心咨询并签署知情同意书，根据孕周的不同，在B超引导下进行绒毛或羊水或脐血穿刺取样后，同时进行染色体核型分析及QF-PCR检测。

1.3染色体核型分析 按照常规细胞培养、收获、制片G显带，参照人类细胞遗传学命名的国际体制(2013年)标准进行核型分析。

1.4QF-PCR检测方法

1.4.1STR位点 采用北京阅微基因技术有限公司的非整倍体检测试剂盒对常见21、18、13及性染色体非整倍体进行检测。共检测27个位点，包括21号染色体的8个STR位点，分别为D21S2052、D21S1411、D21S1446、LFG21、D21S1435、D21S11、D21S1246、Penta D；18号染色体的6个STR位点，分别为D18S51、D18S535、D18S1002、D18S877、D18S851、D18S391；13号染色体的6个STR位点，分别为D13S256、D13S797、D13S317、D13S305、D13S800、D13S325；性染色体的7个STR位点，分别为DXS6809、DXS9895、AMEL、TAF9L(3号染色体和X染色体)、ZFXY、SRY、XHPRT。

1.4.2标本DNA的提取 按Chelex-100法[8]提取脐血、羊水、绒毛等标本的DNA。

1.4.3PCR扩增 在Bio-Rad T100型PCR扩增仪上扩增，反应条件：95 ℃ 5 min预变性，然后 94 ℃ 30 s、60 ℃ 1 min、70 ℃ 1 min，循环 27 次，再60 ℃延伸 60 min，最后扩增产物于 4 ℃避光保存备用。

1.4.4毛细管电泳 取甲酰胺8.5 μL，分子质量标记物0.5 μL，PCR扩增产物 1.0 μL，于95 ℃变性 3 min，放置冰上迅速冰冷 3 min，用 ABI 3500 Dx 型遗传分析仪进行毛细管电泳。

1.4.5结果分析及判断标准 采用GeneMapper®ID-X软件对电泳原始数据进行分析。参照英国临床分子遗传协会(CMGS)2012年新颁布的指南进行分析。(1)双峰比值为0.8～1.4视为正常；当峰标记长度大于或等于24 bp时，峰高度或面积比值达1.5时也可视为正常。(2)三峰比值为1∶1∶1及双峰比值为2∶1(1.8～2.4)或1∶2(0.45～0.65)视为异常；(3)当双峰比值在1.4～1.8或0.65～0.80时，需要对该样本进行重测。(4)单峰一般为纯合，不能提供诊断信息。45，X诊断的标准必须具备以下两个条件:(1)所有X染色体STR位点呈单峰；(2)TAF9L基因座上的两个峰高比为2∶1(1.8～2.4)。

2 结 果

2.1两种方法的检测结果比较 应用QF-PCR方法成功检测3 398例样本，共检出非嵌合型染色体数目异常152例，见表1。其中21三体综合征92例，18三体综合征30例，13三体综合征6例，X单体 6例，XXX 1例，XXY 11例，XYY 5例，XXX合并18三体综合征1例，上述检测结果与核型分析结果一致。嵌合型染色体数目异常7例，QF-PCR检出3例，分别是1例18三体综合征嵌合体，1例21三体综合征嵌合体，1例XXX与XX嵌合体，还有4例嵌合体QF-PCR未能检出。另外，有2例QF-PCR结果与核型分析结果不符。1例QF-PCR结果为XYY，染色体核型结果为46，X，?der(Y),另1例QF-PCR结果为XY，染色体核型结果为45，X。

表1 QF-PCR检测的5种染色体非整倍体结果与核型分析结果

2.2其他染色体核型分析异常结果 共检出其他染色体核型分析异常100例，包括染色体易位65例、倒位14例、缺失7例的结构异常和其他染色体数目异常14例，因不在QF-PCR检测范围内，未能检测到。

2.3检出1例双三体 在3 398例胎儿样本中，发现1例XXX合并18三体综合征的双三体，核型结果为48，XXX,+18见图1、2。

图1 XXX,+18 QF-PCR检测结果图

图2 48,XXX,+18的核型分析结果

2.4产前地贫基因诊断同时进行QF-PCR检测的结果 患有地贫的夫妇双方进行产前地贫基因诊断的1 041个家庭，同时进行了QF-PCR检测，地贫基因产前诊断结果为轻型或正常，而QF-PCR则检出2例21三体综合征，1例XXY染色体非整倍体异常胎儿。

3 讨 论

QF-PCR检测是利用STR遗传标记在人群中的多态性，采用多重PCR扩增及毛细管电泳技术，通过分析各STR点荧光峰的个量或面积的比值从而达到判断染色体数目[9]。QF-PCR技术与G显带的核型分析方法相比，具有以下优点：(1)快速。核型分析方法因需要对胎儿活细胞进行培养，至少要2～3周才能出结果，而QF-PCR可在24～48 h内得出结果，大大缩短了报告时间，减轻了孕妇在等待报告过程中产生的心理负担和焦虑；(2)所需的样本量少，可以同时进行单基因病的诊断；(3)操作简便、自动化程度高、通量大；(4) 可以根据STR等位基因的个性化信息判别多余染色体的来源，鉴别母体组织污染。但是QF-PCR技术仍存在以下不足：(1)目前QF-PCR只能检测13、18、21、X及Y这5条染色体的数目异常，对其他染色体数目异常无法检出;(2)对比例低的嵌合体异常无法检出;(3)不能诊断染色体结构异常。

本报道中的3 398例产前标本采用QF-PCR技术检测，均在24～48 h内成功得出结果。共检出非嵌合型13、18、21、X及Y 5种染色体数目异常152例，与核型分析结果一致，说明QF-PCR技术检测常见5种染色体非整倍体有较高的特异度和灵敏度，与文献报道相符[10]。用QF-PCR方法是检测不到的嵌合比例低于15%～20% 的嵌合体[11]，本研究中的7例嵌合体检出3例，嵌合比例都大于30%。1例QF-PCR结果为XYY，而染色体核型结果为46，X，?der(Y)。疑是2个Y染色体在着丝粒连接成一个衍生的Y染色体。1例QF-PCR结果为XY，染色体核型结果为45，X，未检出Y染色体。可能是含有Y基因的Y片段易位至X染色体或其他常染色体上，其社会性别将表现为男性，但未能有生育能力[12]。检出1例X三体加18三体综合征的双三体。双三体是少见的染色体数目异常。非整倍体的发生机制是由于生殖细胞分裂过程中同源染色体不分离所造成,且多发生于第一次减数分裂时,其结果形成三体性或单体性异常。双三体则由于双原发不分离所造成[13]。在18三体综合征中双三体病例占5%～10%[13]。

广东省为地贫高发区，在某些地区地贫基因携带率可高达16.83%[14]。中重度地贫患儿的出生会给家庭和社会造成巨大疾病和经济负担。目前通过采取婚前、孕前检查，以及产前筛查和诊断等防控措施，可减少重型地贫儿的出生。在进行产前地贫基因诊断的同时进行QF-PCR检测常见染色体数目异常，不增加所取的样本量，就可以避免缺陷儿的出生。在本报道中的患有地贫的夫妇双方进行产前地贫基因诊断的1 041个家庭，检出2例21三体综合征，1例XXY，及时终止妊娠，避免了染色体异常胎儿的出生。

4 结 论

QF-PCR技术用于诊断产前染色体非嵌合型非整倍体如13、18、21、X及Y异常，具有快速，准确、通量大和操作简单等优点，避免了孕妇及家属长时间等待核型分析结果的焦虑,也避免了延至妊娠后期流产对孕妇身体造成较大的创伤。但QF-PCR技术目前只能检出5种常见染色体的数目异常,不能检出染色体结构异常和其他染色体数目异常。 因此，QF-PCR技术同其他快速产前诊断技术一样,不能代替传统的G显带核型分析，仅可作为核型分析的一种有力补充。