RECK、MMP9蛋白在三阴性乳腺癌中的表达及与患者临床特征及预后的关系

周宁，谭晓殊，许婷婷，王帆荣，胡书娅

四川绵阳四〇四医院病理科，四川绵阳621000

三阴性乳腺癌占全部乳腺癌类型的20%[1]，是乳腺癌的亚型之一，其雌激素受体（estrogen receptor，ER）、孕激素受体（progesterone receptor，PR）和人表皮生长因子受体2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）表达均为阴性，好发于50岁以下年轻女性，远处转移和复发率高，预后较差[2]。基质金属蛋白酶9（matrix metalloproteinase 9，MMP9）可分解基底膜中的纤维连接蛋白和层粘连蛋白，促进肿瘤细胞迁移[3]，Kazal基序富含半胱氨酸的逆转诱导蛋白（reversion inducing cysteine rich protein with Kazal motifs，RECK）是一种基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）抑制剂，在抑制肿瘤细胞迁移、侵袭等过程中有重要作用[4-5]。目前，RECK、MMP9在三阴性乳腺癌发生发展中的作用尚不清楚，因此，本研究探讨RECK、MMP9在三阴性乳腺癌中的表达情况及其与患者临床特征和预后的关系，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2015年1月至2017年1月四川绵阳四〇四医院收治的三阴性乳腺癌患者。纳入标准：均经病理活检确诊为三阴性乳腺癌；既往未接受过手术和放化疗治疗。排除标准：合并其他脏器功能障碍；合并炎性乳腺癌或其他部位恶性肿瘤。依据纳入和排除标准，本研究共纳入43例三阴性乳腺癌患者，年龄32～65岁，平均年龄为（35.14±5.87）岁，≥45岁29例，＜45岁14例；肿瘤直径：≤2 cm 23例，＞2 cm 20例；淋巴结转移27例，无淋巴结转移16例；组织学分级：G1级11例，G2级25例，G3级7例；TNM分期：Ⅰ期17例，Ⅱ期20例，Ⅲ期6例。同期选取了43例健康体检者，年龄30～69岁，平均年龄为（35.74±6.03）岁。两组受试者年龄比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。

1.2 免疫组化染色方法

取三阴性乳腺癌患者的三阴性乳腺癌组织标本和对照组受试者正常乳腺组织标本，常规切片5 μm、脱蜡。组织切片放入pH=8.0的乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）修复液中，高压锅内高压2.5 min，3%过氧化氢室温孵育20 min，正常兔血清封闭非特异性抗原15 min。磷酸盐缓冲液（phosphate buffered solution，PBS）冲洗后，加入鼠抗人MMP9单克隆抗体和RECK多克隆抗体，37℃孵育60 min，4℃放置过夜。PBS冲洗3次，加入二抗，37℃孵育40 min，PBS冲洗3次，滴加链霉抗生物素蛋白-过氧化物酶（streptavidin-peroxidase，SP）溶液，37℃放置 30 min，二氨基联苯胺（diaminobenzidine，DAB）显色，苏木素复染，脱水、透明、封片，在显微镜下观察RECK、MMP9蛋白的染色情况，选取PBS代替一抗作为阴性对照。

1.3 结果判定

RECK、MMP9蛋白主要定位于细胞质，以细胞质呈棕黄色颗粒判定为细胞阳性。依据着色强度进行评分：无着色计0分，浅黄色计1分，棕黄色计2分，棕褐色计3分；依据阳性细胞所占比例进行评分：阳性细胞所占比例＜10%计0分，阳性细胞所占比例为10%～25%计1分，阳性细胞所占比例为26%～50%计2分，阳性细胞所占比例为51%～75%计3分，阳性细胞所占比例＞75%计4分。将着色强度和阳性细胞所占比例评分相加，总分＜3分为阴性表达，≥3分为阳性表达。

1.4 随访方法

采用电话随访和门诊复诊的方式，对所有三阴性乳腺癌患者进行随访，随访截止时间为2019年5月，无失访病例。

1.5 统计学方法

采用SPSS 25.0软件对所有数据进行统计分析。计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用t检验；计数资料以例数和率（%）表示，组间比较采用χ2检验，等级资料的比较采用秩和检验；相关性分析采用Spearman秩相关分析；采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线，生存情况的比较采用Log-rank检验；以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 RECK、MMP9蛋白表达情况的比较

三阴性乳腺癌组织中RECK蛋白的阳性表达率为32.56%（14/43），明显低于正常乳腺组织的93.02%（40/43），差异有统计学意义（χ2=33.644，P＜0.01）。三阴性乳腺癌组织中MMP9蛋白的阳性表达率为88.37%（38/43），明显高于正常乳腺组织的6.98%（3/43），差异有统计学意义（χ2=57.100，P＜0.01）。

2.2 不同临床特征三阴性乳腺癌患者三阴性乳腺癌组织中RECK、MMP9蛋白的阳性表达情况

不同TNM分期、组织学分级、淋巴结转移情况三阴性乳腺癌患者三阴性乳腺癌组织中RECK蛋白阳性表达率比较，差异均有统计学意义（Z=6.479、10.689，P＜0.05；χ2=4.669，P＜0.05）；不同年龄、肿瘤直径三阴性乳腺癌患者三阴性乳腺癌组织中RECK蛋白阳性表达率比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。不同淋巴结转移情况三阴性乳腺癌患者三阴性乳腺癌组织中MMP9蛋白阳性表达率比较，差异有统计学意义（χ2=6.749，P＜0.05）；不同年龄、肿瘤直径、TNM分期和组织学分级三阴性乳腺癌患者三阴性乳腺癌组织中MMP9蛋白阳性表达率比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。（表1）

表1 不同临床特征三阴性乳腺癌患者三阴性乳腺癌组织中RECK、MMP9蛋白的阳性表达情况（n=43）

2.3 RECK、MMP9蛋白表达的相关性分析

Spearman秩相关分析结果显示，RECK蛋白与MMP9蛋白表达呈负相关（r=-0.527，P＜0.05）。

2.4 RECK、MMP9蛋白表达情况与三阴性乳腺癌患者预后的关系

43例三阴性乳腺癌患者随访6～30个月，中位随访时间29个月，复发21例，死亡3例。随访30个月时，RECK蛋白阳性表达三阴性乳腺癌患者的无进展生存率为71.4%，高于RECK蛋白阴性表达患者的31.0%，差异有统计学意义（χ2=5.820，P＜0.05）；MMP9阳性表达三阴性乳腺癌患者的无进展生存率为36.8%，低于MMP9阴性表达患者的100%，差异有统计学意义（χ2=4.935，P＜0.05）。（图1、图2）

图1 RECK阳性表达（n=14）和RECK阴性表达（n=29）三阴性乳腺癌患者的无进展生存曲线

图2 MMP9阳性表达（n=38）和MMP9阴性表达（n= 5）三阴性乳腺癌患者的无进展生存曲线

3 讨论

乳腺癌是一种异质性肿瘤，包括Luminal A型、Luminal B型、HER2过表达型和basal-like型。不同类型的乳腺癌具有不同的临床特征和分子生物学特征，对治疗的反应和预后也不尽相同。三阴性乳腺癌患者因ER、PR、HER2均为阴性表达而不适用于内分泌治疗和靶向治疗[6-7]，组织学分级和侵袭性更高，复发率和病死率较其他类型的乳腺癌更高[8-9]。

RECK是一种转化抑制基因，可在转录后水平抑制MMP9的表达，也可通过抑制MMP9的分泌来抑制肿瘤细胞侵袭、转移和新生血管生成[10-12]。RECK基因也可抑制上游启动子与转录因子特异性位点的结合，抑制细胞的不典型增生和癌变[13-14]。RECK在正常组织中表达水平较高，但在食管癌、胃癌、胆管癌、胰腺癌等多种上皮源性肿瘤组织中表达明显降低或缺失，在系统性红斑狼疮等免疫系统疾病组织中表达水平也较低。本研究结果显示，三阴性乳腺癌组织中RECK蛋白的阳性表达率为32.56%，明显低于正常乳腺组织的93.02%，差异有统计学意义（P＜0.01），与张靖[15]、Bravaccini和Maltoni[16]的研究结果一致，表明RECK表达缺失可能参与了三阴性乳腺癌的发生发展过程。研究显示，子宫内膜癌组织中RECK的阳性表达率较低，且随着临床分期的增高而逐渐降低[17-18]，表明RECK在恶性肿瘤发生发展中扮演关键的角色。本研究结果显示，不同TNM分期、组织学分级、淋巴结转移情况三阴性乳腺癌患者三阴性乳腺癌组织中RECK蛋白阳性表达率比较，差异均有统计学意义（P＜0.05），表明RECK表达水平较低或缺失可能与三阴性乳腺癌细胞的迁移和侵袭等生物学行为密切相关。为了解RECK与三阴性乳腺癌患者预后关系，本研究通过长期随访发现，RECK蛋白阳性表达三阴性乳腺癌患者的无进展生存率为71.4%，高于RECK蛋白阴性表达患者的31.0%，差异有统计学意义（P＜0.05），表明可通过检测RECK的表达情况预测三阴性乳腺癌患者的预后，为临床治疗提供参考。

MMP是高度保守内肽酶，能降解基底膜和细胞外基质所有蛋白，MMP9属于MMP家族成员，具有MMP结构特点，可通过降解明胶和Ⅳ型胶原破坏基底膜完整性，有助于肿瘤细胞的生长、侵袭和转移[19-20]。肿瘤组织中MMP9的表达水平较高，方明等[3]分别观察三阴性乳腺癌组织、乳腺增生组织和正常乳腺组织中MMP9表达的差异，结果显示，三阴性乳腺癌组织中MMP9的阳性表达率最高，且MMP9阳性表达与三阴性乳腺癌淋巴结转移情况有关，与本研究结果一致。吴凤兰[10]的研究结果显示，RECK蛋白表达下调，可减弱对MMP9的抑制作用，从而促进肿瘤细胞的浸润和转移。本研究结果显示，RECK与MMP9的表达呈负相关，表明RECK和MMP9可能在三阴性乳腺癌的发生发展中存在关联机制，临床可通过上调RECK的表达，抑制MMP9的表达，从而抑制肿瘤细胞的迁移和转移等过程，达到抗肿瘤治疗的目的。预后分析发现，MMP9同样与三阴性乳腺癌患者预后密切相关，MMP9阳性表达三阴性乳腺癌患者无进展生存率为36.8%，低于MMP9阴性表达患者的100%，差异有统计学意义（P＜0.05），这与RECK和MMP9表达呈负相关的结论一致。临床应重视MMP9表达水平较高的恶性肿瘤患者，积极采取措施抑制肿瘤进展，加强随访和干预，以积极改善患者预后。但本研究样本例数较少，可能导致结果偏倚，应在以后研究中进一步扩大样本量，增加观察指标，为三阴性乳腺癌诊疗提供更可靠参考。

综上所述，三阴性乳腺癌组织中RECK的表达水平较低，MMP9的表达水平较高，RECK蛋白的表达可能与三阴性乳腺癌患者的TNM分期、组织学分级和淋巴结转移情况有关，MMP9蛋白的表达可能与淋巴结转移情况有关。RECK蛋白阴性表达和MMP9蛋白阳性表达的三阴性乳腺癌患者预后较差。