高压氧联合化疗对裸鼠食管癌组织中PTEN、HIF-1α表达的影响及作用机制研究△

鲁志刚，贾慧琼，张欣，鲁艳

内蒙古医科大学附属医院1胸外科，2高压氧科，呼和浩特 010050

3内蒙古医科大学生理学教研室，呼和浩特010010

食管癌是中国常见的一种消化系统恶性肿瘤，其发病率和病死率均高于世界主要发达国家水平[1]。高压氧（hyperbaric oxygen，HBO）是临床用于治疗外伤、缺血、缺氧性疾病的常见手段[2]，过去由于担心高氧分压会促进肿瘤生长、导致肿瘤复发，HBO在恶性肿瘤中的应用起步较晚[3]。Feldmeier等[4]研究指出，HBO用于恶性肿瘤是安全的；后续研究指出，HBO甚至可能对某些恶性肿瘤亚型具有生长抑制作用，对肿瘤放射治疗有增强作用[5]。因此，深入研究恶性肿瘤氧合作用及其增强放化疗疗效的机制十分必要[6]。目前，HBO对恶性肿瘤的作用研究已在乳腺癌、神经胶质瘤、血液肿瘤、结直肠癌及泌尿系肿瘤中开展[7]，但在食管癌中的研究较少。本研究建立了裸鼠食管癌模型，采用HBO联合化疗方式进行干预，观察该联合方式的治疗效果，并对磷酸酶及张力蛋白同源基因（phosphate and tension homolog，PTEN）、缺氧诱导因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）的表达情况进行分析，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物

BALB/c裸鼠40只，4～6周龄，体质量18～22 g，雌性与雄性裸鼠各20只，均购自北京维通利华实验动物技术有限公司；TE-1人食管癌细胞购自中国科学院昆明细胞库。

1.2 食管癌模型建立

参考胡翠梨等[8]方法建立裸鼠食管癌模型，随机选取30只BALB/c裸鼠采用皮下接种法向裸鼠右侧腋部皮下注入甲基苄基亚硝胺（methyl-benzyl-nitrosamine，MBNA），每次3.5 mg/kg，每周2次，连续注射20周，建立食管癌大鼠模型。以瘤结节直径达0.5 cm作为成瘤标准。选取30只食管癌成模裸鼠及10只同期饲养的健康裸鼠用于后续实验。

1.3 实验分组及治疗方案

将同期饲养的10只健康裸鼠作为对照组，采用随机数字表法将30只食管癌模型裸鼠随机分为模型组、化疗组、化疗联合HBO组（联合组），每组10例。对照组与模型组裸鼠均给予5 ml/kg生理盐水灌服，每天1次，共30天；化疗组裸鼠给予4 mg/ml替加氟溶液灌服，5 ml/kg，每天1次，共30天；联合组在化疗组裸鼠的基础上给予HBO治疗（在应用化疗药物前进行），2.0绝对大气压稳压吸氧60 min，每天1次，治疗10天，停10天，再治疗10天，共30天。

1.4 观察指标及评价标准

治疗结束后处死裸鼠，测量所有食管癌模型裸鼠的肿瘤大小，肿瘤体积=瘤体长径×瘤体短径²×0.5。取对照组裸鼠的正常食管黏膜组织和其他3组裸鼠的移植瘤组织，采用免疫组织化学半定量分析正常食管黏膜组织和移植瘤组织中PTEN、HIF-1α的表达情况。每张切片在高倍镜（×400）下随机选取5个具有代表性的视野拍照，使用图像分析软件IPP 6.0（image pro plus 6.0）进行光密度测量：选择图片上免疫组化反应物的黄色区域（排除细胞核上蓝色的复染区域不会影响测量），然后测量这些区域的平均光密度（optical density，OD）值，取5个视野测量值的平均值。免疫组织化学法结果判定：细胞质或细胞核内出现棕黄颗粒为PTEN、HIF-1α表达阳性。

1.5 统计学方法

采用SPSS 22.0软件对数据进行统计分析。符合正态分布的计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，两两间比较采用SNK-q检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肿瘤体积的比较

治疗后，模型组、化疗组、联合组裸鼠的肿瘤体积分别为（47.20±4.43）、（25.45±3.79）、（20.40±4.47）cm3，三组间比较，差异有统计学意义（F=112.730，P＜0.01）。其中，化疗组与联合组裸鼠的肿瘤体积均小于模型组，差异均有统计学意义（P＜0.05）；联合组裸鼠的肿瘤体积小于化疗组，差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.2 PTEN及HIF-1α表达水平的比较

对照组裸鼠正常食管黏膜组织和模型组、化疗组、联合组裸鼠的移植瘤组织中PTEN和HIF-1α的表达水平比较，差异均有统计学意义（F=29.549、23.788，P＜0.01）。模型组、化疗组和联合组裸鼠的移植瘤组织中PTEN的表达水平均低于对照组，HIF-1α的表达水平均高于对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05）；模型组裸鼠的移植瘤组织中PTEN的表达水平低于化疗组和联合组，HIF-1α的表达水平高于化疗组和联合组，差异均有统计学意义（P＜0.05）；化疗组裸鼠的移植瘤组织中PTEN的表达水平低于联合组，HIF-1α的表达水平高于联合组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。（表1）

表1 不同组别裸鼠中PTEN、HIF-1α表达水平的比较（±s）

表1 不同组别裸鼠中PTEN、HIF-1α表达水平的比较（±s）

注：a与对照组比较，P＜0.05；b与模型组比较，P＜0.05；c与化疗组比较，P＜0.05

组别对照组（n=10）模型组（n=10）化疗组（n=10）联合组（n=10）0.386±0.102 0.053±0.011a 0.205±0.083a b 0.278±0.095a b c 0.032±0.019 0.313±0.121a 0.239±0.065a b 0.166±0.070a b c PTEN HIF-1α

3 讨论

包括食管癌在内，各类型的实体瘤组织中均有不同程度的缺氧，而缺氧环境可以刺激肿瘤细胞分泌血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF），促进肿瘤新血管生成，因此缺氧可能促进恶性肿瘤的生物学演进[9]。相关研究指出，低氧环境可导致肿瘤细胞基因组的不稳定，使肿瘤细胞维持在未分化状态，从而促进肿瘤细胞发生间充质转化，提高肿瘤细胞的侵袭和转移能力[10]。因此，改善肿瘤微环境缺氧状态成为近年来肿瘤治疗的新手段，其中HBO是最常见而简便的手段[11]。目前，HBO联合放疗或化疗在食管癌治疗方面的研究较少，临床研究具体实践参数资料缺乏，因此本文拟从动物实验开始研究HBO对肿瘤微环境的影响，为后续HBO的临床应用提供参考。

Yang等[12]研究发现，低氧刺激可以促进肾透明细胞癌细胞增殖，而通过miRNA-146a下调CADM2表达可以减缓肾透明细胞癌细胞的增殖速率。本研究结果显示，化疗组与联合组裸鼠的肿瘤体积均小于模型组（P＜0.05），而联合组裸鼠的肿瘤体积小于化疗组（P＜0.05）。提示HBO联合化疗在裸鼠食管癌模型中可以有效缩小肿瘤体积，较单独应用化疗的疗效更好。Qi等[13]研究表明，高氧分压状态下肿瘤细胞对化疗药物的敏感性增加。由于本研究仅对食管癌模型裸鼠进行了30天的HBO治疗，明显短于实际化疗时间；而且本研究为预实验，每组仅10只裸鼠，因此下一步还需要增加样本量，进一步研究食管癌细胞对HBO联合化疗的敏感性[14]。

HIF-1广泛存在于人和哺乳动物体内，由HIF-1α和HIF-1β两种异源二聚体组成[15]，其中β亚基可以在细胞质中稳定表达，而α亚基在有氧条件下会被细胞内氧依赖性泛素蛋白酶快速降解，而缺氧环境中HIF-1α可稳定存在[16]。本研究结果显示，各组裸鼠中HIF-1α的表达水平由高到低依次为模型组、化疗组、联合组及对照组，且组间两两比较差异均有统计学意义（P＜0.05）。提示在HBO作用下，食管癌组织中氧分压增高，可以降低HIF-1α的表达水平。Masoud和Li[17]研究指出，HIF-1可以促进VEGF基因转录，并增强VEGFmRNA的稳定性，从而促进肿瘤的新血管生成。因此，HIF-1可以间接减少肿瘤血管生成，从而抑制肿瘤生长[18]。

PTEN基因位于第10号染色体，由9个外显子组成，可编码403个氨基酸，合成PTEN蛋白[19]。Shen等[20]研究表明，PTEN高表达可以降低HIF-1的稳定性。本研究结果显示，各组裸鼠中PTEN的表达水平由高到低依次为对照组、联合组、化疗组及模型组，组间两两比较差异均有统计学意义（P＜0.05）。提示HBO可以增强PTEN的表达，间接增加了对HIF-1表达的阻断作用。此外，PTEN具有磷酸酯酶的活性，对黏着斑激酶（focal adhesion kinase，FAK）等磷酸化酶有拮抗作用，Jaraíz-Rodríguez等[21]研究发现，PTEN基因异常的胶质母细胞瘤细胞的FAK活性明显增高；转染野生型PTEN基因后，细胞的FAK活性明显降低，而且肿瘤细胞的增殖、侵袭能力也均明显降低。Kuchay等[22]研究发现，PTEN蛋白还可以通过抑制肌醇三磷酸（inositol triphosphate，IP3）的活性，间接地抑制胰岛素（insulin）/IP3/磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）细胞生长信号通路的活性。上述研究表明，PTEN蛋白可能是一种作用广泛的肿瘤抑制因子。

综上所述，HBO联合化疗可以上调食管癌裸鼠模型肿瘤组织中PTEN的表达，同时下调HIF-1α的表达，提高化疗药物对食管癌的杀灭效果。