Trop-2基因在肝癌组织中的表达及对HepG 2细胞增殖的影响

张健，马海#，杨柳，杨红春，何振兴

南充市中心医院1普外科，2呼吸内科，四川 南充637000

肝癌为临床常见的一种恶性肿瘤，在过去20年中，全世界肝癌的发病率和病死率均增长了约1倍[1]。在中国，肝癌的发病率和病死率分别居恶性肿瘤第3位和第2位，严重威胁着人们的生命健康[2]。肿瘤相关钙信号转导蛋白2（tumor-associated calcium signal transducer 2，Trop-2）是GA733基因家族中的一个细胞表面受体，负责转导Ca2+信号[3]。相关研究表明，Trop-2在肺腺癌、胃癌和卵巢浆液性囊腺癌等多种恶性肿瘤中高表达，且其高表达能够促进肿瘤的生长，与患者的预后不良有关[4-6]。Trop-2高表达可能参与肿瘤的恶性生物学行为，但其在肝癌中的作用及作用机制尚不明确。蛋白激酶 C-α（protein kinase C alpha，PKC-α）作为上游调节因子，通过磷酸化核因子κB抑制因子（inhibitor of nuclear factor kappa B，IκB）激活核因子-κB（nuclear factor of kappa B，NF-κB），从而促进卵巢癌的发展[7]。本研究探究了Trop-2基因在肝癌组织和肝癌细胞中的表达情况，并进一步探究了其对肝癌细胞增殖的影响，旨在为肝癌的预后和靶点治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

选取2016—2017年于南充市中心医院行手术切除的10例肝癌患者的肝癌组织标本和癌旁正常组织标本，所有患者在手术之前均未接受任何治疗。人肝癌细胞株HepG2、人高转移肝癌细胞株HCCLM3和人正常肝细胞株HL-7702均购自武汉普诺赛公司。

1.2 主要试剂与仪器

DMEM培养基和双抗（青霉素和链霉素）均购自美国Hyclone公司，南美胎牛血清购自美国Hyclone公司，PE Mouse Anti-Human Trop-2（564837）、Cycletest Plus DNA Reagent kit均购自美国BD生物公司，兔抗人Trop-2、兔抗人PKC-α、兔抗人p-PKC-α和兔抗人NF-κB抗体均购自美国Abcam公司，辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）标记的羊抗兔免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）二抗购自美国CST公司，总RNA提取试剂盒、CCK-8试剂盒均购自北京索莱宝科技有限公司，Prime-ScriptTMRT reagent kit、SYBR Premix Ex TaqTMⅡ试剂盒均购自宝生物工程（大连）有限公司，Trop-2和β-acting引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。TDZ4-WS型台式低速离心机购自长沙湘仪离心机仪器有限公司，MCO-15AC型二氧化碳培养箱购自三洋电机国际贸易有限公司，酶标仪（Multlskan）购自赛默飞世尔仪器有限公司，Cytoflex型流式分析仪购自美国Beckman公司。

1.3 Trop-2 siRNA引物序列设计

在GeneBank中查找Trop-2的基因序列，设计Trop-2siRNA和无关序列的寡核苷酸。Trop-2siRNA上游引物：5'-CACCTTCAAGACGTTTTTTG-3'，下游引物：5'-AGCTCAAAAAACGTCTTGAA-3'；阴性对照siRNA上游引物：5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3'，下游引物：5'-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3'。以上引物序列由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.4 细胞培养及转染

将人肝癌细胞HepG2、人高转移肝癌细胞HCCLM3和人正常肝细胞HL-7702分别接种于含10%胎牛血清的DMEM培养基中，置于5%CO2、37℃培养箱中培养。待细胞融合度达80%时，进行传代培养或进行实验。收集处于对数生长期的HepG2细胞，分为3组：空白对照组，仅添加Lipofectamine 2000不做转染的HepG2细胞；阴性对照组，转染无关序列的HepG2细胞；Trop-2siRNA组，转染Trop-2siRNA序列的HepG2细胞。采用Lipofectamine 2000进行转染，6 h后更换培养液，24 h后收集细胞进行后续实验。细胞转染步骤严格参照试剂盒操作说明书进行。

1.5 免疫组织化学染色法检测不同组织中Trop-2蛋白的表达情况

取肝癌组织和癌旁正常组织，常规石蜡包埋切片后，65℃烤片30 min，二甲苯脱蜡，梯度乙醇脱水。3%过氧化氢室温浸泡15 min后，采用磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）冲洗3次，每次5 min，滴加5%牛血清蛋白封闭液，置于37℃培养箱中培养30 min，吸去多余液体，滴加1∶100稀释的Trop-2一抗，4℃冰箱过夜。37℃培养箱复温30 min，PBS清洗3次，每次5 min。滴加IgG，37℃培养箱孵育30 min后，PBS冲洗3次，每次5 min。滴加链霉抗生物素蛋白-生物素-过氧化物酶复 合 物（streptavidin-biotin-peroxidase complex，SABC）试剂，37℃培养箱孵育30 min后PBS清洗3次，每次5 min。3，3’-二氨基联苯胺（3，3’-diaminobenzidine，DAB）显色5 min（显微镜下控制），使细胞质均匀着黄棕色，自来水终止显色，苏木素复染细胞核2～3 min，水洗，1%盐酸乙醇分化（快速），梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性光学树脂封片。采用PBS替代一抗作为阴性对照组。使用IPP 6.0软件对免疫组化图片进行积分光密度值（integral optical density，IOD）检测。

1.6 实时荧光定量PCR检测不同组织中Trop-2 mRNA表达

采用总RNA提取试剂提取肝癌组织及癌旁正常组织中的总RNA，使用逆转录试剂盒Prime-Script™RT reagent kit进行逆转录，制备 cDNA，各cDNA样品分别用下列引物进行实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）。Trop-2上游引物：5'-CCTCATCGCCGTCATCGT-3'；下游引物：5'-CGGTTCCTTTCTCAACTCCC-3'。β-actin上游引物：5'-CACGAAACTACCTTCAACTCC-3'；下游引物：5'-CATACTCCTGCTTGCTGATC-3'。反应体系12.5 μl：SYBR Premix Ex TaqTMⅡ 6.25 μl、上游引物0.5 μl、下游引物 0.5 μl、双蒸水 4.25 μl、cDNA 1 μl；反应条件：95℃预变性3 min；95℃变性10 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共25个循环。以βactin为内参，以2-ΔΔCt法计算肝癌组织及癌旁正常组织中Trop-2mRNA的相对表达量。实验重复3次。

1.7 流式细胞术检测不同细胞中Trop-2蛋白表达

取对数生长期的未经转染的HepG2、HCCLM3和HL-7702细胞，接种于DMEM培养基中培养至融合度达80%时收集细胞，参照FIX/PERM试剂盒操作说明书，在培养液中加入100 ml Reagent A室温孵育10 min，400g离心5 min，吸弃上清液；采用适量PBS洗涤2次，每次3 min，350g离心5 min，吸弃上清液，加入100 μl Reagent B混匀后，加入PE Mouse Anti-Human Trop-2，避光混匀，4℃避光反应30 min，PBS洗涤2次，每次3 min，350g离心5 min，吸弃上清液，加入1%多聚甲醛重悬细胞后，采用流式细胞仪检测HepG2细胞、HCCLM3细胞及HL-7702细胞中Trop-2蛋白的表达水平。实验重复3次。

1.8 蛋白质印迹法（Westernblot）检测蛋白表达量

1.8.1 不同组织中相关蛋白检测 肝癌组织和癌旁正常组织中相关蛋白检测：取适当大小的组织块，加入300 L细胞裂解液，置于冰上裂解30 min，其间在涡旋器上进行充分混合；然后以12 000 r/min于4℃离心20 min，收集上清液。采用二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）法进行蛋白质定性，每4 μl蛋白质样品中加入1 μl十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）蛋白上样缓冲液（5×），混合蛋白质样品和缓冲液，煮沸5 min，样品于-20℃保存备用。使用等量蛋白质上样，选择10%SDS-PAGE进行分离，分离后的蛋白质转移至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上，用5%的脱脂奶粉封闭1 h，封闭结束后结合一抗（Trop-2、PKC-α、p-PKC-α、NF-κB和β-actin均按1∶400稀释），4℃孵育过夜后TBST清洗，然后加入二抗（稀释比例均为1∶5000）室温孵育1 h，TBST清洗，ECL暗室显色。显色后的蛋白使用Bio-Rad全功能成像系统采集图像，Image-ProPlus分析光密度，以β-actin为内参，检测肝癌组织和癌旁组织中NF-κB、PKC-α、p-PKC-α、Trop-2的相对表达量。实验重复3次。

1.8.2 不同细胞中相关蛋白检测 收集处于对数生长期的未经转染的HepG2、HCCLM3、HL-7702细胞和转染后的空白对照组、阴性对照组、Trop-2siRNA组HepG2细胞，预冷PBS冲洗2次，每次3 min，每孔加入约100 μl全细胞蛋白质裂解液，振荡混匀，置冰上10 min后将细胞收集于1.5 ml离心管中。裂解体系在冰上进行超声作用，每次3 s，共3次，每次间隔1 s，超声后的裂解体系于4℃、13 000 r/min离心5 min并收集上清。用BCA法进行蛋白质定量。其余操作方法同“1.8.1”。计算未经转染的HepG2、HCCLM3和HL-7702细胞中Trop-2的相对表达量及空白对照组、阴性对照组、Trop-2siRNA组HepG2细胞中Trop-2、NF-κB、PKC-α和p-PKC-α蛋白的相对表达量。实验重复3次。

1.9 CCK-8法检测细胞增殖率

取处于对数生长期的阴性对照组、Trop-2siRNA组HepG2细胞，调整细胞浓度为4×104/ml，接种于96孔板中，继续培养24 h后，每孔加入10 μl CCK-8，4 h后终止培养，采用酶标仪于450 nm波长下测定细胞吸光度值。实验重复3次。

1.10 统计学分析

采用SPSS 20.0软件对数据进行分析。符合正态分布的计量资料以均数±标准差（±s）表示，两组间比较采用独立样本t检验，3组间比较用单因素方差分析（ANOVA-LSD）；计数资料以例数表示。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同组织中Trop-2蛋白表达水平的比较

免疫组织化学染色结果显示：肝癌组织细胞质中浅黄色颗粒较多，癌旁正常组织细胞质中浅黄色颗粒极少（图1）。IPP6.0软件对免疫组织化学染色图片进行IOD检测，结果显示：肝癌组织中Trop-2蛋白的相对表达量为（0.27±0.01），明显高于癌旁正常组织的（0.23±0.01），差异有统计学意义（t=12.637，P＜0.01）。

图1 肝癌组织和癌旁正常组织中Trop-2蛋白的表达情况（免疫组织化学染色法，×400）

2.2 不同组织中Trop-2 mRNA表达水平的比较

qRT-PCR检测结果显示：肝癌组织中Trop-2mRNA的相对表达量为（5.60±1.19），明显高于癌旁正常组织的（0.98±0.18），差异有统计学意义（t=12.066，P＜0.01）。

2.3 不同细胞中Trop-2蛋白的表达情况

流式细胞术检测结果显示：HCCLM3细胞和HepG2细胞中Trop-2蛋白的相对表达量分别为（91.21±2.50）%、（94.14±2.36）%，均明显高于HL-7702细胞的（7.97±1.50）%，差异均有统计学意义（t=49.550、53.440，P＜0.01）（图2）。Western blot检测结果显示，HCCLM3细胞和HepG2细胞中Trop-2蛋白的相对表达量分别为（0.91±0.08）、（0.81±0.04），均高于HL-7702细胞的（0.67±0.06），差异均有统计学意义（t=4.157、3.363，P＜0.05）（图3）。

图2 流式细胞术检测Trop-2蛋白在未经转染的 3种细胞中的表达情况

图3 Western blot检测Trop-2蛋白在未经转染的 3种细胞中的表达情况

2.4 Westernblot检测不同组织中相关蛋白的表达

肝癌组织中p-PKC-α、NF-κB和Trop-2蛋白的相对表达量均明显高于癌旁正常组织，差异均有统计学意义（P＜0.01）。肝癌组织中PKC-α蛋白的相对表达量与癌旁正常组织比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。（表1）

表1 不同组织中相关蛋白表达水平的比较（±s）

表1 不同组织中相关蛋白表达水平的比较（±s）

组织类型肝癌组织癌旁正常组织t值P值0.97±0.03 0.47±0.07 2.947＜0.01 1.02±0.05 0.78±0.07 0.154＜0.01 0.93±0.07 0.91±0.07 0.845＞0.05 1.03±0.05 0.77±0.05 0.030＜0.01 Trop-2 p-PCK-α PCK-α NF-κB

2.5 沉默Trop-2对肝癌HepG 2细胞相关蛋白的影响

Western blot检测结果显示：Trop-2siRNA组HepG2细胞中Trop-2、p-PKC-α、PKC-α和NF-κB蛋白的相对表达量均低于空白对照组和阴性对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05）；阴性对照组HepG2细胞中Trop-2、p-PKC-α、PKC-α和NF-κB蛋白的相对表达量与空白对照组比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。（表2）

表2 不同组别HepG 2细胞中相关蛋白表达水平的比较（±s）

表2 不同组别HepG 2细胞中相关蛋白表达水平的比较（±s）

注：a与空白对照组比较，P＜0.05；b与阴性对照组比较，P＜0.05

组别空白对照组阴性对照组Trop-2 siRNA组1.03±0.08 1.02±0.11 0.81±0.10a b 0.98±0.03 1.02±0.11 0.71±0.12a b0.97±0.03 0.93±0.09 0.78±0.06a b 1.00±0.00 0.98±0.10 0.73±0.11a b Trop-2 p-PCK-α PCK-α NF-κB

2.6 沉默Trop-2对肝癌HepG 2细胞增殖的影响

CCK-8法检测结果显示：Trop-2siRNA组HepG2细胞的增殖率为（76.953±9.043）%，低于阴性对照组的（96.940±15.752）%，差异有统计学意义（t=6.564，P＜0.05）。

3 讨论

Trop-2由Lipinski在1981年首次从滋养层细胞膜上发现，并证实其在正常组织中几乎不表达。乔宇[8]在对影响直肠癌转移及预后的因子进行分析时发现，Trop-2在直肠癌组织中的表达水平明显高于癌旁组织，且与患者的肿瘤分期、淋巴结转移和远处转移情况有关。Heist等[9]对肺癌患者行Trop-2抗体联合肿瘤药物治疗，结果显示该联合方案治疗可以延缓患者的病情进展。目前，关于Trop-2在肝癌发生发展中作用机制的研究尚少。因此，本研究对Trop-2在肝癌组织和细胞中的表达情况进行研究，结果显示，肝癌组织中Trop-2蛋白和mRNA的相对表达量均高于癌旁正常组织（P＜0.05）；流式细胞术和Western blot法对人肝癌细胞株HepG2、人高转移肝癌细胞株HCCLM3和人正常肝细胞株HL-7702中Trop-2蛋白的表达水平进行检测，结果显示HepG2细胞和HCCLM3细胞中Trop-2蛋白的相对表达量均高于HL-7702细胞（P＜0.05）。提示Trop-2可能促进肝癌细胞的恶性增殖或迁移，可作为肝癌预后的标志基因。为了验证这一推测，本研究采用RNA干扰技术沉默细胞中Trop-2基因表达，结果发现Trop-2沉默后，HepG2细胞增殖率被显著性降低。进一步说明了Trop-2可能参与了肝癌的发生、发展，可以作为肝癌预后的标志基因。本研究上述结果也与乳腺癌、肺癌和头颈部鳞状细胞癌等恶性肿瘤报道的结果相一致[10-11]。

Trop-2作为一种跨膜钙信号传感器，能够与PKC-α催化区结合，并磷酸化细胞质中的PKC-α，使其转移至细胞膜并激活下游其他蛋白[12]。本研究采用Western blot法检测不同组织中PKC-α和p-PKC-α的表达情况，结果发现肝癌组织中p-PKC-α蛋白的相对表达量明显高于癌旁组织（P＜0.01），但两种组织中PKC-α蛋白的相对表达量比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。提示PKC-α可能是Trop-2的下游基因，过表达的Trop-2与PKC-α相结合，可以促进其激活。也有学者推测，Trop-2与PKC-α之间是一种正反馈调节，Trop-2被激活后，促使更多的PKC-α被磷酸化，而p-PKC-α又促进Trop-2的激活，这种正反馈调节在细胞凋亡过程中发挥着重要作用[13]。正常生理条件下，NF-κB与抑制因子IκBα在细胞质中形成复合物，其功能活性被抑制；当受到上游配体或细胞外刺激激活后，IκB蛋白激酶复合物（inhibitor of nuclear factor kappa-B kinase，IKK）进入细胞核，调节相关因子表达。庞雪莲[14]对PKC-α与NF-κB在食管癌中的关系进行研究，结果显示PKC-α被磷酸化后，可以激活NF-κB上游激酶IKK，最终激活NF-κB，提高肿瘤细胞的迁移能力。本研究采用蛋Western blot法对肝癌组织和癌旁正常组织中NF-κB的表达水平进行检测，结果显示，与癌旁正常组织相比，肝癌组织中NF-κB的相对表达量明显增高（P＜0.01）。提示在肝癌组织中被激活的PKC-α可能同样激活了NF-κB。上述研究表明，Trop-2可能通过调控PKC-α/NF-κB通路影响肝癌的发生、发展。为了进一步验证Trop-2对PKC-α和NF-κB的影响，本研究采用Trop-2siRNA干扰Trop-2表达，结果显示：Trop-2siRNA组HepG2细胞中p-PKC-α、PKC-α和NF-κB蛋白的相对表达量均低于空白对照组和阴性对照组，表明Trop-2是PKC-α-NF-κB通路的上游基因。

综上所述，Trop-2在肝癌组织中高表达，其可能通过PKC-α/NF-κB通路调控肝癌的发生发展，通过靶向沉默Trop-2可以抑制肝癌细胞的增殖，但其具体调节机制还需要更进一步的深入了解和研究。