不同培养基对羌活植物细胞悬浮培养的影响

王跃华, 屈锡梅, 任 倩, 史斯予， 王一品(.成都大学 药学与生物工程学院， 四川 成都 6006； .成都列五中学， 四川 成都 60007)

0 引 言

羌活为伞形科植物羌活或宽叶羌活的干燥根茎和根，主要用于外感风寒、头痛无汗、寒湿痹、风湿疼痛等症.羌活主要含有挥发油、香豆素、有机酸、糖类及甾醇类化合物[1-2].羌活的主要药效成分羌活醇和异欧前胡素属于香豆素类，目前为止，羌活中发现的香豆素类化合物有64个[3-4].近年来，为了快速繁殖羌活以缓解羌活野生资源面临的危机，科研人员利用组培技术来快速提高羌活的产量，取得了一系列成果[5-6].在此基础上，本研究通过比较不同基础培养基种类、蔗糖浓度、硝态氮和铵态氮的比值、总氮含量等因素对羌活植物悬浮细胞生长的影响，确定了羌活植物细胞悬浮培养的最佳培养基条件，拟为后续的羌活植物细胞悬浮培养体系的建立提供相关实验依据.

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材 料.

实验所用材料，由固体培养基中以羌活芽鞘为外植体诱导出的浅黄色愈伤组织.

实验所用试剂包括：植物激素NAA、2,4-D、6-BA，均购自成都科龙化工试剂厂.

1.1.2 仪 器.

实验所用仪器包括：SW-QJ-2F型超净工作台(苏州安泰空气技术有限公司)，HZQ-F160A型恒温振荡培养箱(上海一恒科学仪器有限公司)，PHS-3C型pH计(上海仪电科学仪器股份有限公司)，LD型电子天平(沈阳龙腾电子有限公司).

1.2 方 法

1.2.1 基本培养基的筛选.

配制基本培养基B5、MS、N6、White及H，同时添加激素6-BA 0.5 mg/L、NAA 0.5 mg/L及蔗糖30 g/L配制成液体培养基.分装100 mL培养基于250 mL的三角瓶中，调节pH值为6.0，灭菌后备用.取生长良好的浅黄色羌活愈伤组织，小心去掉表面残存的培养基，用无菌水清洗3次，接种量约为2.0 g/100 mL接种至已灭菌的培养基中，接种之后再称量，记录实际的接种量.将三角瓶放置于摇床上振荡培养，设定摇床参数90 r/min，25 ℃，光照时间8 h，光照强度800 lx，每2 d观察1次，30 d后过滤得细胞培养物，在滤纸上吸干水分，获得新鲜培养物，称重，计算并筛选出最佳的培养基.每个处理3个重复.

1.2.2 不同蔗糖浓度的MS液体培养基配制.

以MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L作为悬浮培养的培养基，并设置蔗糖浓度为10 g/L、20 g/L、30 g/L、40 g/L、50 g/L，分装等其他方法同“1.2.1".取生长良好的浅黄色羌活愈伤组织，小心去掉表面残存的培养基，用无菌水清洗3次，接种量约为2.0 g/100 mL，接种完成之后再次称重，记录实际接种量.将三角瓶放置于摇床上震荡培养， 培养条件及统计

方法同“1.2.1".筛选出最佳蔗糖浓度.每个处理3个重复.

1.2.4 不同总氮含量的MS液体培养基配制.

以MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L+蔗糖30 g/L作为悬浮培养的培养基，设置总氮含量分别为1/4 N、1/2 N、1 N、2 N共4个处理.1 N代表初始含氮量为MS培养基中总氮量不变(NH4NO3=1 650 mg/L，KNO3=1 900 mg/L)； 2N代表MS培养基中总氮量增加1倍(NH4NO3=3 300 mg/L，KNO3=3 800 mg/L)；以此类推，1/2 N为MS培养基总氮量的1/2(NH4NO3=850 mg/L，KNO3=950 mg/L)；1/4 N为MS培养基的总氮量的1/4(NH4NO3=425 mg/L，KNO3=475 mg/L).分装等其他方法同“1.2.1".取生长良好的浅黄色羌活愈伤组织，小心去掉表面残存的培养基，用无菌水清洗3次，接种量约为2.0 g/100 mL，接种完成之后再次称重，记录实际接种量.培养条件及统计方法同“1.2.1"，筛选出最佳总氮含量.每个处理3个重复.

1.2.5 悬浮培养细胞的鲜重测量.

取在4 000 r/min的条件下离心10 min后去除上清液的羌活植物悬浮细胞，滤纸吸干表面水分，称量鲜重，计算生物量增殖倍数.实验重复3次.

1.2.6 细胞生长测定计算公式以及数据分析.

细胞增殖倍数计算公式为，

细胞增殖倍数=(收获时的鲜重-接种时的鲜重)/接种时的鲜重.

细胞生长速率换算成每天每升培养基增加的细胞重克数，即g/(L·d)，表示生长速率.即，

生长速率=(收获时的鲜重-接种时的鲜重量)/(培养天数×培养液体积).

2 结果与分析

2.1 培养基种类对羌活植物悬浮细胞生长的影响

本实验配制了B5、MS、N6、White及H 5种基本培养基，并添加激素6-BA 0.5 mg/L、NAA 0.5 mg/L及蔗糖30 g/L，在250 mL三角瓶中装入100 mL基本培养液，并接入2.0 g/100 mL分散良好的浅黄色羌活愈伤组织，培养30 d后，统计结果见表1.

表1 培养基种类对羌活植物悬浮细胞生长的影响

由表1可知，A1用MS作为基本培养基，羌活植物悬浮细胞增殖倍数和生长速率均最大，分别是2.185±0.031和(1.457±0.021) g/(L·d)，这是因为MS属于高盐浓度的培养基，且含有NH4NO3，故最有利于羌活植物悬浮细胞的生长；在A3中，当用White作基础培养基时，羌活植物悬浮细胞的增殖倍数和生长速率最低，这是因为White为低盐培养基，且White培养基不含铵盐，并且各离子浓度都较低，故最不利于羌活悬浮细胞的生长；在A2和A4中，以B5和N6作为基本培养基时，由于B5和N6均含高浓度的硝酸钾，但B5中含有较低浓度的铵，故以B5作为基本培养基时，羌活植物悬浮细胞的生长情况略好于以N6作为基本培养基时的生长情况；在A5中，由于H为中盐基本培养基，故略高于以White作为基础培养基时对羌活植物悬浮细胞生长的影响.结果表明，以MS作为基本培养基，最有利于羌活植物悬浮细胞的生长.

2.2 蔗糖浓度对羌活植物悬浮细胞生长的影响

在植物细胞中，蔗糖常常用作提供植物生长的标准碳源，能更好地维持培养基中的渗透压[7]，本研究以不同浓度的蔗糖为碳源，在实验中以MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L作为基础培养基，并分别添加10 g/L、20 g/L、30 g/L、40 g/L、50 g/L不同浓度的蔗糖，配制5种培养液，并接入2.0 g/100mL的分散良好的浅黄色羌活愈伤组织，培养30 d后，统计结果见表2.

由表2可知， 羌活植物悬浮细胞的生长随着蔗糖浓度的增加呈现先增加后降低的现象.在B3中，当蔗糖浓度达到30 g/L时，羌活植物悬浮细胞的增殖倍数和生长速率均最大，分别为2.185±0.031和(1.457±0.021) g/(L·d)，此条件下的羌活悬浮细胞数量较多，细胞分散性良好，呈淡绿色；在B1中，蔗糖浓度为10 g/L时，对羌活植物悬浮细胞的生长影响最低，这是由于蔗糖浓度过低，培养液中的蔗糖还不足以维持羌活植物细胞的生长，此时羌活植物悬浮细胞体积较小，形态变化不明显；在B4～B5中，随着蔗糖浓度的升高，羌活植物悬浮细胞的生长则受到抑制，这是因为蔗糖作为限制性基质存在，当浓度过高时影响了培养液中的渗透压，且出现了基质抑制效应[8].结果表明，培养基中蔗糖浓度为30 g/L时，最有利于羌活植物悬浮细胞的生长.

表2 蔗糖浓度对羌活植物悬浮细胞生长的影响

表比值对羌活植物悬浮细胞生长的影响

2.4 总氮含量对羌活植物悬浮细胞生长的影响

本实验配制4种不同总氮含量的MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L+蔗糖30 g/L基础培养基，接入2.0 g/100mL的分散良好的浅黄色羌活愈伤组织，培养30 d后，统计结果见表4.

表4 总氮含量对羌活植物悬浮细胞生长的影响

由表4可知，在F2培养基中，当总氮含量为1/2 N时，羌活植物悬浮细胞的增殖倍数和生长速率达到最大，分别是2.703±0.025和(1.802±0.017) g/(L·d)，此时的羌活植物悬浮细胞生长状态最佳；在F3和F4培养基中，随着总氮含量的增加，羌活植物悬浮细胞的生长速率逐渐下降，也逐渐出现褐化现象；在F4培养基中，当总氮含量为2 N时的羌活植物悬浮细胞增殖倍数和生长速率降到最低，这说明低浓度的总氮含量比高浓度的总氮含量更利于羌活植物悬浮细胞的生长，且高浓度的总氮含量中，铵态氮的含量也会增加，对细胞会产生一定的毒性.因此，总氮含量为1/2 N时最有利于羌活植物悬浮细胞的生长.

3 结 论