孙文霞, 陈 勇(成都大学 四川抗菌素工业研究所, 四川 成都 610052)
伏格列波糖,化学名为(+)-1L-[1(羟基),2,4,5/3]-5-[2-羟基-1-(羟甲基)乙基]氨基-1-碳-(羟甲基)-1,2,3,4-环已四醇,是一种从放线菌培养液中发现的天然糖类似物,能够抑制小肠壁细胞a-葡萄糖苷酶的活性,从而有效改善糖尿病餐后血糖,目前广泛用于I、II型糖尿病的防治[1-5].2006年,伏格列波糖口腔速溶膜剂面世,并得到广泛使用,但目前关于控制其质量的相关文献较少.对此,本研究通过建立柱后衍生HPLC荧光检测法,测定伏格列波糖口腔速溶膜中伏格列波糖的含量和有关物质,以有效控制伏格列波糖口腔速溶膜剂的质量.
实验所用材料包括:伏格列波糖对照品(批号,100826-200801,纯度99.2%),由中国食品药品检定研究院提供;伏格列波糖口腔速溶膜(批号,140711、140712、140713,规格为0.2 mg),由四川抗菌素工业研究所提供;伏格列波糖口腔速溶膜(批号,4C11W,规格为0.2 mg),购自日本救急药品工业株式会社;乙腈为色谱纯,购自美国fisher公司;水为重蒸馏水,其余试剂均为分析纯.
实验所用仪器包括:LC-20AB型高效液相色谱仪、RF-10AXL型荧光检测器、CRB-6A型化学反应箱、LC-Solution色谱工作站(日本岛津公司);FE-20型pH计(梅特勒—托利多公司);CPA-225D型十万分之一电子天平(赛多利斯科学仪器(北京)有限公司).
实验的色谱条件为:含量测定用色谱柱为COSMOSIL 5C18-PAQ柱(250 mm×4.6 mm,10 μm);有关物质测定用色谱柱为Shodex Asahipak NH2P-50 4E柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);含量测定流动相为0.045%辛烷磺酸钠的磷酸盐缓冲液(取3.12 g磷酸二氢钠二水合物,加水1 000 mL使其溶解,用磷酸调pH值至3.5)—甲醇(94∶6);有关物质测定流动相为磷酸缓冲液(取1.56 g磷酸二氢钠二水合物溶解于500 mL水中,另取3.58 g十二水磷酸氢二钠溶解于500 mL水中,用磷酸调pH值至6.5, 将2种溶液混合均匀)—乙腈(37∶63);荧光检测器激发波长为350 nm,发射波长为430 nm;柱温为25 ℃;荧光衍生试剂的制备方法为,取牛磺酸6.25 g、高碘酸钠2.56 g溶解至1 000 mL水中,摇匀,即得;反应浴温度为100 ℃,聚四氟乙烯反应管长20 m(内径0.5 mm),冷却浴温度为15 ℃,聚四氟乙烯冷却管长2 m(内径0.3 mm);流动相与荧光试剂流速相同,含量测定为1.0 mL/min,有关物质测定为0.6 mL/min;进样量100 μL.
2.2.1 供试品溶液配制.
取本品10片,剪碎,置于50 mL量瓶中,加流动相40 mL,超声处理10 min,放冷,用流动相稀释至刻度,摇匀,过滤,精密量取续滤液1 mL,置10 mL量瓶中,用流动相稀释至刻度,摇匀,作为含量测定用供试品液.另取本品10片,剪碎,置5 mL量瓶中,加流动相4 mL,超声处理10 min,放冷,用流动相稀释至刻度,摇匀,过滤,取续滤液作为有关物质检查用供试品溶液.
2.2.2 对照品溶液配制.
精密称取伏格列波糖对照品10 mg,置25 mL量瓶中,用流动相溶解并稀释至刻度,摇匀,精密量取1 mL,置10 mL量瓶中,用流动相稀释至刻度,摇匀,作为对照品溶液.
2.2.3 对照溶液配制.
精密量取1.0 mL“2.2.1”项下有关物质检查用供试品溶液,置100 mL量瓶中,用流动相稀释至刻度,摇匀,作为有关物质检查用对照溶液.
精密量取“2.2”项下含量测定用供试品溶液和对照品溶液各100 μL,注入液相色谱仪,记录色谱图.按外标法计算出供试品中伏格列波糖的含量.
精密量取“2.2”项下对照溶液100 μL注入液相色谱仪,调节检测灵敏度,使主成分色谱峰的峰高为满量程的20%.再精密量取“2.2”项下有关物质检查用供试品溶液100 μL注入液相色谱仪,记录色谱图至主成分峰保留时间的2.5倍.供试品溶液的色谱图中如显杂质峰,扣除辅料峰后,单个杂质峰面积不得大于对照溶液峰面积的0.2倍(0.2%),各个杂质峰面积之和不得大于对照溶液峰面积的0.5倍(0.5%).
2.5.1 专属性.
取本品适量(批号140711,约相当于伏格列波糖2.0 mg),置于5 mL的容量瓶中,平行制备6份,进行破坏性实验,具体包括:
1)高温破坏.样品经100 ℃高温加热约4 h;
2)光照破坏.样品在光照度为(4 500±500) lx下放置10 d.
3)氧化破坏.样品加30%双氧水0.5 mL,放置1 h.
4)酸破坏.样品中加1 mol/L的盐酸0.5 mL,放置4 h后,用1 mol/L的氢氧化钠至中性.
5)碱破坏.样品加1 mol/L的NaOH溶液0.5 mL,放置4 h,加1 mol/L 的HCl溶液至中性.
上述经破坏的样品均用流动相稀释至刻度,摇匀,过滤,取续滤液按照“2.1”项下色谱条件进行测定.结果显示:本品经光照和高温破坏,主峰面积有所下降,杂质个数和峰面积均有所增加;在经酸、碱和双氧水破坏后主峰面积明显降低,说明该药对酸、碱和双氧水不稳定.相邻杂质与主成分色谱峰分离较好,分离度大于1.5,说明所建方法的专属性强.破坏性实验色谱如图1所示.
图1 破坏性实验色谱图
2.5.2 线性关系.
精密称取伏格列波糖对照品适量,用流动相制成每1 mL中含伏格列波糖25.0、32.0、40.0、45.0、50.0 μg的溶液,分别精密吸取100 μL注入液相色谱仪,记录色谱图.以峰面积Y对伏格列波糖X(μg/mL)进行线性回归,得回归方程为,Y=243 345X-811 215.73(R=0.9999,n=5).结果表明,伏格列波糖浓度与色谱峰面积在25.0~50.0 μg/mL范围内线性关系良好.
2.5.3 进样精密度.
精密量取“2.2”项下对照品溶液和对照溶液各100 μL,分别注入液相色谱仪,记录色谱图,连续测定6次,峰面积的RSD分别为0.52%和0.76%.结果表明,仪器的进样精密度良好.
2.5.4 重复性.
取同一批样品(批号,140711),按“2.2.1”项下方法平行制备6份含量测定用供试品液,按“2.1”项下色谱条件分别进样分析,计算得到含量分别为100.23%、100.06%、100.35%、100.74%、101.45%和101.63%,RSD为0.65%(n=6).结果表明,方法的重复性良好.
2.5.5 中间精密度.
精密称取样品(批号,140711),按照“2.2”项下的方法配制成含量测定用供试品溶液和对照品溶液,于不同日期,不同操作人员在不同仪器上按“2.3”项下方法测定,并按外标法计算伏格列波糖口腔速溶膜的含量,其含量的RSD为0.77%(n=6).结果表明,中间精密度良好.
2.5.6 回收率.
取本品10片置100 mL容量瓶中,加流动相80 mL,照“2.2.1”项下方法制成浓度为0.02 mg/mL的供试品母液,精密量取该母液1 mL置10 mL容量瓶中,平行制备9份,分别加入“2.2.2”项下对照品溶液4 mL(80%)、5 mL(100%)、6 mL(120%),用流动相稀释至刻度,每个浓度平行制备3份.按“2.3”项下方法测定,计算回收率,结果如表1所示.
表1 回收率实验结果
2.5.7 检测限与定量限.
取“2.2.2”项下对照品溶液逐级稀释,按“2.1”项下色谱条件测定,以信噪比S/N=3和S/N=10计,测得伏格列波糖的检测限和定量限分别为2 ng和10 ng.
取3批样品,照“2.3”和“2.4”项下方法进行含量和有关物质测定,结果见表2.
表2 样品含量和有关物质检测结果
由于伏格列波糖分子结构中不含共轭基团,无紫外吸收,因而无法采用HPLC-UV法.目前相关文献中测定伏格列波糖的方法主要有HPLC-ELSD法[6]、HPLC-RID法[7]、离子色谱法[8]、柱前衍生化GC法[9]、柱后衍生HPLC荧光检测法[10-14]以及高效液相色谱—质谱法[15].伏格列波糖口腔速溶膜剂作为一种新的剂型,尚未有关于其有关物质和含量测定的相关文献报道.对此,本研究参考日本药典中伏格列波糖原料和伏格列波糖片剂的标准,采取柱后衍生HPLC荧光检测法进行相关物质与含量的测定.
在日本的药典中,采用氨基丙基硅烷填料色谱柱进行含量测定,考虑到该色谱柱用量较少,结合本实验室的条件,参考国家药品标准,采用C18色谱柱.由于长时间运行纯水相流动相时柱子使用寿命较短,故对流动相条件进行优化,当流动相为0.045%辛烷磺酸钠的磷酸盐缓冲液(取3.12 g磷酸二氢钠二水合物,加水1 000 mL使溶解,用磷酸调pH值至3.5)—甲醇(94∶6),伏格列波糖的保留时间以及对称性较好,但是考虑到水相比例仍较高,因而选择亲水性很好的COSMOSIL 5C18-PAQ柱.此外,在日本的药典中,伏格列波糖原料药对3个已知杂质即杂质1、杂质2及杂质3分别进行了限定.而文献[16]的研究表明,该3个杂质为原料药合成工艺过程所引入,并非伏格列波糖降解杂质.结合本研究的破坏实验结果,其均未在相应保留时间处产生杂质峰,故本研究认为可不对本品中3个已知杂质进行限制.