温度对以枫槭叶为原料的美拉德反应产物的分布及卷烟加香的影响

许春平，曲利利，白家峰，农李政，陈义昌，许霭飞，马扩彦，刘绍华*

1.郑州轻工业大学食品与生物工程学院，郑州高新技术产业开发区科学大道166 号 450001

2.广西中烟工业有限责任公司技术中心，南宁市北湖南路28 号 530001

3.重庆中烟工业有限责任公司技术研发中心，重庆市南岸区南坪东路2 号 400060

近年来，利用微生物发酵技术［1］、酶解技术［2-3］、美 拉德反应［4-5］等由天然产物的提取物制备烟用香料的报道较多，利用这些技术不但可以改善烟气的品质，还可以提高原料的利用率。利用酶解技术结合美拉德反应制备烟用香料的研究也有报道。马海昌［6］以烟梗为原料，通过外加酶法制备烟梗的水提取液，采用微生物发酵产香结合美拉德反应生产烟用香料，产出的香料能够丰富卷烟香味，减轻不利气味。胡希等［7］以新鲜的红心猕猴桃为原料，利用果胶酶、糖化酶和纤维素酶对其进行降解，然后通过自身的美拉德反应制成香料，不仅能够丰富雪茄烟的风格，而且可以使雪茄烟吃味甘甜、舒适，烟气醇和柔和。骆莉等［8］采用外源活性酶对烟梗进行处理，利用微生物发酵结合美拉德反应技术，不仅能增加烟梗提取液风味物质的质量分数，还能改善烟梗提取液品质。徐若飞等［9］以天然香菇为原料，采用酶解法和美拉德反应结合技术开发新型烟用香料，产出的香料可以增加烟香，柔和烟气，增加细腻性和甜润感。王吉中等［10］以槐花为原料，采用酶解法和美拉德反应法制备槐花香料，所得挥发性香味物质种类比用水直接提取法和单独酶解法多。

枫槭浸膏是一种传统的食品用天然香料（在《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》中的编码为N062）［11］和烟用香料，在食品和卷烟行业应用广泛。枫槭浸膏是枫槭叶粉末经乙醇提取、浓缩后得到的提取物，枫槭浸膏在卷烟中应用时可赋予卷烟焦甜香、烘烤香等香韵。苏东赢［12］采用裂解-气相色谱-质谱联用（Py-GC-MS）技术模拟卷烟燃烧过程，将枫槭浸膏在不同温度下进行热裂解，对裂解产物进行定性、定量分析，并进行卷烟加香实验，发现枫槭浸膏在烟丝中的添加量为0.02%时可突出焦甜香韵和改善卷烟的抽吸品质。蔡莉莉等［13］分析了5种市售枫槭浸膏的挥发性成分，并采用单因素方差分析和主成分分析法比较了其挥发性成分的差异。前人的研究主要集中在市售枫槭浸膏的化学成分分析，未见枫槭叶美拉德反应产物的相关研究报道。本研究中以枫槭叶为原料，通过复合酶酶解将枫槭叶粉末中的蛋白质和多糖转化为氨基酸和还原糖，然后对枫槭叶粉末酶解液进行不同温度（70、80、90、100、110 ℃）下的美拉德反应，采用GC-MS 联用技术对枫槭叶粉末酶解液的美拉德反应产物进行定性分析和主成分分析，将制备的美拉德反应产物应用到烟丝上并进行加香评吸，考察其加香效果，旨在为烟用天然香料的开发提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂和仪器

枫槭叶（广东梅州2017 年产）；空白烟（广西中烟工业有限责任公司）。

纤维素酶（酶活50 000 U/g）、果胶酶（酶活100 000 U/g）、半纤维素酶（酶活200 000 U/g）（江苏锐阳生物科技有限公司）；木瓜蛋白酶（酶活600 000 U/g）（北京索莱宝科技有限公司）；1,2-丙二醇、1 moL/L H2SO4、二氯甲烷、无水乙醇（AR，天津市富宇化工有限公司）；1.245 mg/mL 乙酸苯乙酯（色谱纯，美国Sigma-Aldrich 公司）。

Q-100A3 高速多功能粉碎机（上海冰都电器有限公司）；RLGOL Ultra-3400 紫外分光光度计［梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司］；DGX-9143 电热恒温鼓风干燥箱（上海福玛设备有限公司）；TGL-16M 离心机（上海卢湘仪离心机仪器有限公司）；同时蒸馏萃取装置（郑州科技玻璃仪器厂）；GC6890-MS5973N 型气相色谱-质谱联用仪（美国Agilent 科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 预处理

称取200 g枫槭叶，置于60 ℃烘箱中烘烤10 min，自然冷却至室温；粉碎过孔径25 μm（300 目）筛，枫槭叶粉末装于密封袋后置冰箱中保存。

1.2.2 样品酶解处理

取枫槭叶粉末，平均分成若干份，每份质量为15.0 g，每份均以料液比1∶10（质量∶体积，g/mL）的比例加150 mL 水。

加酶量对氨基酸和还原糖的影响：酶解时间5 h，酶解温度50 ℃，pH 为5，酶解加酶量分别为底物的1.0%、1.5%、2.0%、2.5%（4 种酶分别为纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶、木瓜蛋白酶，4 种酶的添加比例为1∶1∶1∶1）。

pH 对氨基酸和还原糖的影响：酶解时间5 h、酶解温度50 ℃，酶解加酶量为底物的1.5%，酶解液pH 分别为5、6、7、8。

酶解时间对氨基酸和还原糖的影响：酶解温度50 ℃，酶解的加酶量为底物的1.5%，酶解液pH为5，酶解时间分别是4、5、6、7 h。

1.2.3 还原糖和氨基酸的测定

采用DNS 法测定水溶性还原糖［14］，以葡萄糖标准液浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，在520 nm 波长处测定8 个样品的还原糖吸光度，计算得到其标准曲线方程。

采用茚三酮法测定水溶性氨基酸［15］，以氨基酸标准液浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，在570 nm波长处测定6 个样品的氨基酸吸光度，计算得到其标准曲线方程。

通过标准曲线及稀释倍数按公式（1）计算氨基酸或还原糖的质量分数（mg/g）：

式中：m—氨基酸或还原糖的质量分数，mg/g；V—氨基酸或还原糖的体积，mL；c—氨基酸或还原糖的浓度，mg/mL；n—稀释倍数；m0—样品质量，g。

1.2.4 以枫槭叶粉末为原料进行美拉德反应

将30%的氢氧化钠溶液分别加到150 mL 未加酶的和加酶的枫槭叶粉末溶液中，调节体系pH 为7，然后分别置于70、80、90、100、110 ℃烘箱中反应3 h［16-17］，得到不同的美拉德反应产物。

1.2.5 美拉德反应产物香味成分分析［18-21］

在同时蒸馏萃取装置的平底烧瓶中加入美拉德反应产物，再加入100 mL 蒸馏水，摇匀，在电子调温电热套中加热，在装置的另一端蒸馏瓶中加50 mL二氯甲烷，在60 ℃水浴锅中加热。当二氯甲烷与水出现分层时开始计时，2.5 h 后萃取结束，待冷却后，在二氯甲烷萃取液中加入10 g无水硫酸钠和1 mL 浓度为1.245 mg/mL 的乙酸苯乙酯，静置过夜。在35～40 ℃的水浴锅中浓缩至1 mL，用0.45 μm有机相微孔滤膜过滤，以乙酸苯乙酯为内标，进行GC/MS 分析，采用峰面积归一化法测量美拉德反应产物挥发性成分的质量分数［22］。GC/MS条件：

色谱柱：HP-5MS 色谱柱（30 m×250 μm×0.25 μm）；载气：氦气；载气流速：3 mL/min；进样口温度：280 ℃；分流比：10∶1；进样量：1 μL；升温程序：50 ℃280 ℃；离子源：EI 源；接口温度：270 ℃；电子能量：70 eV；四极杆温度：150 ℃；采集模式：扫描；质量扫描范围：35～550 amu；检索谱库：NIST11 库。

1.2.6 美拉德反应产物卷烟加香感官评价

将不同温度美拉德反应产物在体系压力95 kPa、水浴50 ℃条件下旋转蒸发浓缩，得到枫槭浸膏样品，用95%乙醇将其稀释成2%（质量比）的溶液。分别取20 g 空白烟烟丝，按照0.02%（样品占烟丝质量比）称取配好的枫槭浸膏乙醇溶液，用喷雾器均匀喷洒在叶丝上，手工卷制。在温度（22±2）℃，相对湿度（60±5）%的恒温恒湿箱中平衡24 h 后进行评吸。取空白烟加等量乙醇后作对照。由具有广西中烟工业有限责任公司评吸员资质的8 名技术人员从香气质、协调性、刺激性、杂气等方面进行感官评价。

2 结果与讨论

2.1 以氨基酸和还原糖质量分数为指标优化酶解条件

在美拉德反应中，氨基酸和还原糖的种类和质量分数均会对美拉德反应产物有影响。游霞等［23］以烟草废弃物为原料，以还原糖得率为酶反应衡量指标，确定用酶法制备美拉德反应香料；钱敏等［24］研究表明参与反应的氨基酸种类越多，产物中挥发性物质的种数也越多，反应产物的风味越丰富；符笳茵等［25］研究表明在美拉德反应过程中，氨基酸的增量和还原糖的消耗量均与美拉德反应产物的量显著正相关。因此，以氨基酸和还原糖的质量分数为酶反应的衡量指标。还原糖的标准曲线方程为y=0.053 7x+0.123 6，R2=0.993 5；氨基酸的标准曲线方程为y=0.192 1x-0.152 1，R2=0.992 8。由图1～图3 可知，当加酶量为1.5%（图1）、pH 为7（图2）、酶解时间为5 h（图3）时，氨基酸和还原糖的质量分数最大，说明酶解最优加酶量为1.5%，最优pH 为7，最优时间为5 h。其中酶解6 h 与5 h 相比，还原糖质量分数显著降低（图3），这可能是酶解时间延长后酶解液中还原糖浓度较高，导致还原糖“回吸”的缘故［26］。

图1 加酶量对氨基酸和还原糖质量分数的影响Fig.1 Effect of enzyme application rate on contents of amino acid and reducing sugar

图2 pH 对氨基酸和还原糖质量分数的影响Fig.2 Effect of pH on contents of amino acid and reducing sugar

图3 酶解时间对氨基酸和还原糖质量分数的影响Fig.3 Effect of enzymatic hydrolysis time on contents of amino acid and reducing sugar

2.2 不同温度下枫槭叶粉末酶解液美拉德反应产物的GC-MS 分析

对枫槭叶粉末酶解液在不同温度（70、80、90、100、110 ℃）下美拉德反应产物的挥发性成分进行GC-MS 分析。由表1 可知：已鉴定出的美拉德反应产物主要包括酸类、醇类、酯类、酚类、醛类、酮类、烯烃类、烷烃类、酰胺、呋喃类、吡啶类等成分。这些物质的匹配度均大于80%，通常匹配度大于80%的鉴定结果较为可信［27］，已鉴定出的挥发性成分种类由多到少依次为美拉德反应温度90、100、110、80、70 ℃，分别有69、59、49、27、21种成分；挥发性成分的质量分数由多到少对应的美拉德反应温度依次为90、100、110、80、70 ℃，即当美拉德反应温度为90 ℃时，鉴定出的挥发性成分的质量分数最大。

表1 不同温度下枫槭叶粉末酶解液美拉德反应产物挥发性成分的质量分数Tab.1 Contents of volatile components in Maillard reaction products of enzymatic hydrolysate from maple leaf powder at different temperatures (μg·g-1)

表1 （续）

表1 （续）

由图4 和图5 可以看出，未酶解与酶解后的枫槭叶粉末美拉德反应产物的质量分数和挥发性成分种类在70、80、90、100、110 ℃的变化趋势基本一致，均是在90 ℃时质量分数较高，挥发性成分种类较多；酶解后的枫槭叶粉末美拉德反应产物的挥发性成分总量和种类均显著增加。

图4 未酶解和酶解后枫槭叶美拉德反应产物挥发性成分质量分数随温度的变化Fig.4 Variation of volatile component contents in Maillard reaction products from maple leaves without/with enzymatic hydrolysis along with temperature

图5 未酶解和酶解后枫槭叶美拉德反应产物挥发性成分种类随温度的变化Fig.5 Variation of volatile component kinds in Maillard reaction products from maple leaves without/with enzymatic hydrolysis along with temperature

2.3 枫槭叶粉末酶解液经不同温度反应后美拉德反应特征挥发性成分质量分数变化趋势

吡嗪类化合物普遍带有坚果香、烘烤香、甜香，是美拉德反应的重要产物，其阈值较低，对挥发性香味贡献较大［28-29］。四甲基吡嗪、2,3-二甲基吡嗪的质量分数与美拉德反应产物总量的变化趋势基本一致，可以用这2 种吡嗪类化合物作为该反应过程的标志性物质。因此分别以5 个美拉德反应温度梯度为横坐标，以两种美拉德反应产物，即四甲基吡嗪和2,3-二甲基吡嗪的质量分数、美拉德反应产物总量为纵坐标作图（图6）。

图6 美拉德反应特征香味成分质量分数和反应产物总量随温度的变化Fig.6 Variations of characteristic aroma component contents and the total amount of Maillard reaction products along with temperature

由图6 可知，随着温度的升高，四甲基吡嗪和2,3-二甲基吡嗪从无到有，90 ℃时质量分数达到最高，在100 ℃和110 ℃时质量分数又有所下降。研究表明形成吡嗪的机理是α-二羰基化合物和胺通过Strecker 降解发生相互作用［30-31］，Strecker降解反应的发生需要相对较高的反应温度和小分子的苯甲醛存在［32］。由表1 可知，在低温（70、80 ℃）时没有苯甲醛生成，因此也没有2,3-二甲基吡嗪、四甲基吡嗪生成；在90 ℃时检测到苯甲醛，其质量分数较大，为2.0 μg/g，此温度下吡嗪的量也达到最高；在100 ℃和110 ℃时检测到苯甲醛的量逐步降低，这可能抑制了吡嗪的生成，导致吡嗪的量又有所下降［33］。因此，温度对吡嗪类化合物形成的影响显著。

2.4 枫槭叶粉末酶解液经不同温度反应后美拉德反应产物的物理外观

枫槭叶粉末酶解液经不同温度反应后美拉德反应产物的物理外观结果见表2。结果表明：枫槭叶粉末酶解液在90 ℃时的美拉德反应产物物理外观较好，呈深褐色，比较黏稠，香味方面焦糖香和甜香突出。

2.5 加香效果

不同温度美拉德反应产物在卷烟加香后的评吸结果见表3。结果表明：枫槭叶粉末酶解液在90 ℃时的美拉德反应产物应用于卷烟后，可提升卷烟烟气的香气质，改善杂气和刺激性，余味更舒适，加香效果更好。该研究结果与90 ℃是制备枫槭叶粉末酶解液美拉德反应产物最佳温度的结论相一致。

表2 不同温度枫槭叶美拉德反应产物的物理外观和特征香气Tab.2 Physical appearance and characteristic aroma of Maillard reaction products from maple leaves at different temperatures

表3 不同温度枫槭叶美拉德反应产物的卷烟加香评吸结果Tab.3 Results of sensory evaluation of cigarettes containing Maillard reaction products from maple leaves obtained at different temperatures

3 结论

①枫槭叶粉末酶解液经不同温度的美拉德反应，产物的种类和质量分数变化较大，主要包括醇类、酸类、酯类、醛类、酮类、烯烃类、呋喃类、吡嗪类化合物等成分。70、80、90、100、110 ℃下美拉德反应产物的种类分别为21、27、69、59、49 种，挥发性成分质量分数分别32.19、118.6、252.0、194.1、178.5 μg/g；反应温度为90 ℃时，枫槭叶粉末酶解液美拉德反应产物挥发性成分的种类最多，挥发性成分总量最高。②枫槭叶粉末酶解液在90 ℃时美拉德反应产物的特征香味成分（四甲基吡嗪和2,3-二甲基吡嗪）质量分数最高。③枫槭叶粉末酶解液在90 ℃时的美拉德反应产物应用于卷烟后，可提升卷烟烟气的香气质，改善杂气和刺激性，余味更舒适。该结果与90 ℃是制备枫槭叶粉末酶解液美拉德反应产物最佳温度的结论一致。