缺血后处理通过mdm2-p53负反馈通路减轻大鼠缺血再灌注损伤后的氧化应激反应

李晓倩，陈凤收，张再莉，马 虹

0 引言

脊髓缺血再灌注损伤(Spinal cord ischemia reperfusion injury，SCIRI)常见于术中需要短暂阻断脊髓供应血管的手术，如胸腹主动脉瘤手术、脊柱成形手术等，一旦出现可引起不同程度的、难以逆转的运动和感觉功能异常，可造成巨大的经济和社会负担[1]。SCIRI是多细胞交互联系、多诱因、多种病理机制混杂的复杂的疾病过程[2]。随着研究的深入，越来越多的研究发现，广泛的氧化应激反应是SCIRI发生后多种继发性病理损伤急剧发展的关键环节[3-4]。缺血后处理(Ischemic post-conditioning，IPC)是在损伤早期使用机械阻断血流到目标区域的一种人为干预措施，在动物缺血模型中已证实具有良好的神经保护作用[5]。p53是一种最常见的应激传感效应蛋白，既往针对IPC治疗机制的研究中发现，IPC可以通过p53信号通路调控氧化应激反应[6-7]。而鼠双微粒体蛋白2(Murine double-minute 2，mdm2)是p53信号通路中重要的调控因子，可以与p53构成降解-反式激活环路，从而恒定胞内mdm2/p53比值，维持正常的细胞功能和活性[7-8]。在脊髓神经元离体细胞实验中，糖氧剥离可明显下调mdm2水平，干扰两者间的负反馈环路，使p53在核内累积，引起胞内脂质过氧化，激活氧化应激反应[6]。目前在SCIRI中，关于IPC能否通过p53-mdm2负反馈通路调节损伤脊髓中的氧化应激反应的研究甚少，深入研究有助于探求新的临床治疗靶点。故本研究以IPC干预SCIRI模型大鼠，通过观察大鼠后肢运动功能、对脊髓组织中氧化应激代表性产物丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)的检测，探讨IPC的作用机制，为临床治疗提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料 兔抗p53多克隆抗体，兔抗mdm2单克隆抗体、GAPDH(武汉博士德)；MDA测定试剂盒(南京建成生物工程研究)、SOD测定试剂盒(上海放射免疫技术有限公司)；BCA蛋白质测定试剂盒、ECL化学发光试剂盒(碧云天科技有限公司)；HIPAS-1000型图像分析系统(武汉华海公司)；EIx800型酶标仪(美国BIO-TEK公司)。

1.2 实验动物、分组和模型制备 雄性SD大鼠，8～10周龄，体重(200±20)g，购自中国医科大学动物中心。12 h昼夜节律喂养，实验前后可自由进食水。采用随机数码表将60只大鼠分为假手术组(Sham组)、损伤组(IR组)和缺血后处理组(IPC组)，每组20只。参照文献制备模型和IPC治疗[2]。简要过程如下：麻醉后，将大鼠右侧卧位，通过颈胸口切口暴露主动脉弓，直视下将动脉夹夹至左颈总动脉和左锁骨下动脉之间，夹闭14 min诱导缺血，后撤除动脉夹诱导再灌注。Sham组仅暴露主动脉弓而不夹闭动脉夹。IPC组：在再灌注开始5 min后给予5个循环IPC(阻断主动脉弓1 min/开放1 min为1个循环)，其余步骤同IR组。所有大鼠均逐层缝合伤口，腹腔内注射氨苄青霉素30 mg(0.3 ml)预防感染。

1.3 神经功能评价 采用BBB评分测定脊髓神经功能恢复情况[3]。于术后12、24、36、48 h将大鼠放置于直径为2米的圆形平台上自由活动4 min，观察记录其后肢的行走及肢体活动，定量评价损伤后的运动功能。评分分为3个部分：第1部分(0～7分)评判大鼠后肢各关节活动情况；第2部分(8～13分)评判后肢的步态及前后肢协调功能，如是否可见爪掌面承重移动；第3部分(14～21分)评判运动中后肢后爪的精细动作，如是否可见持续性掌面移动、持续性爪抓地等。3项满分为21分。

1.4 脊髓组织SOD和MDA含量测定 术后48 h，取L4-6节段脊髓组织，制成10%脊髓匀浆。低温下以3 500 r/min的速度离心15 min，取上清进行组织蛋白定量。SOD采用黄嘌呤氧化酶法在532 nm波长下测定OD值；MDA采用硫代巴比妥酸法在550 nm波长下测定OD值。

1.5 Western blot测定大鼠脊髓组织中mdm2和p53蛋白表达 匀浆后测定蛋白质样品的浓度。每泳道上样50 μg后，使用10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质。电泳后转至PVDF膜上。5%脱脂奶粉室温下封闭1 h后，将膜加入兔抗mdm2多克隆抗体(1∶500)、兔抗p53单克隆抗体(1∶500)于4 ℃过夜，洗膜后继续二抗室温下孵育90 min。使用ECL试剂盒和HIPAS-1000型图像分析系统记录化学发光结果，以与GAPDH的比值作为表达强度。

2 结果

2.1 各组大鼠损伤后脊髓神经运动功能评价 术后各观察点Sham组大鼠后肢运动和反射能力均无明显异常。与Sham组相比，术后各观察点(尤以24 h为著)，IR组大鼠BBB评分显著降低，出现运动和反射能力下降(P<0.05)，但随着时间延长略有所恢复；与IR组相比，IPC组各观察点的BBB评分明显升高，运动和反射能力有所恢复(P<0.05)。见表1。

2.2 各组大鼠损伤后脊髓组织中MDA和SOD含量的比较 与Sham组相比，IR组和IPC组术后各观察点脊髓组织中MDA含量均明显升高，而SOD含量明显降低，尤以术后24 h变化最为明显(P<0.05)；与IR组相比，IPC组各观察点的MDA含量明显降低，SOD含量明显升高(P<0.05)。见表2、表3。

表1 SCIRI后48 h内大鼠后肢BBB评分的变化

注：*与Sham组比较，P<0.05；#与IR组比较，P<0.05

表2 SCIRI后48 h内大鼠脊髓组织中MDA含量的变化(nmol/mg)

注：*与Sham组比较，P<0.05；#与IR组比较，P<0.05

表3 SCIRI后48 h内大鼠脊髓组织中SOD含量的变化(nU/mg)

注：*与Sham组比较，P<0.05；#与IR组比较，P<0.05

2.3 各组大鼠损伤后脊髓组织中mdm2和p53蛋白含量的比较 Western blot结果显示，损伤后各观察点，与Sham组比较，IR组脊髓组织中mdm2蛋白含量明显下降、p53蛋白含量均明显升高(P<0.05)；与IR组比较，IPC组脊髓组织中mdm2蛋白含量明显升高、p53蛋白含量明显下降(P<0.05)。上述变化在术后24 h变化最为显著。见图1。

图1 SCIRI后48 h内大鼠脊髓组织中mdm2(A)和p53(B)含量的变化

3 讨论

脊髓神经细胞对缺血、缺氧等因素非常敏感，短暂的SCIRI即可引起广泛的神经损伤，出现难以逆转的下肢运动和反射功能障碍。目前尚无有效的监测和预防手段，因此，损伤后有效的治疗至关重要。但SCIRI发生和发展的机制复杂，是涵盖多因素、多机制的综合性病理过程，目前仍无有效的治疗方法。IPC最早发现和应用于心肌损伤过程中，通过在损伤早期及时给予几个短暂的缺血-再灌注循环，进而降低心肌耗氧量、改善心肌代谢，获得了良好的治疗作用[9]。近年来，随着对IPC不断的探索和了解，IPC已逐渐应用于肝、肾、脑等重要脏器中，有研究者提出在再灌注的早期给予IPC治疗能获得更好的效果[10]，因此，本研究在再灌注开始5 min即给予IPC治疗，结果证实5个循环的IPC能够明显提高BBB评分，明显改善大鼠后肢运动和反射能力。

氧化应激反应是SCIRI进行性发展的关键环节[3-4]，如何降低氧化应激反应是既往研究的热点和靶点。Chen等[11]在大鼠大脑中动脉闭塞模型中，通过在再灌注后0、1、3 h分别给予肢体远端缺血后处理，证实远端缺血后处理在再灌注0 h可明显减少NADPH氧化酶活化、降低髓过氧化物酶的含量、抑制氧化应激反应。此外，由于MDA是脂质过氧化反应的最终产物，而SOD也是自身产生的氧自由基清除剂和抗氧化酶，所以除髓过氧化物酶之外，MDA和SOD被认为是另两种代表性监测氧化应激反应的指标[5]。本研究中在损伤后各观察点均发现受损脊髓组织中MDA含量明显升高，而SOD含量明显降低，提示SCIRI后体内发生了进行性加重的氧化应激反应，自身产生的SOD已不足以完全清除过氧化反应的产物。而再灌注期早期(5 min)给予IPC治疗明显逆转体内MDA和SOD含量，提示IPC可通过加强自由基清除作用，阻断氧化应激反应。

此外，既往对IPC保护机制的研究发现，IPC还可以针对应激效应蛋白p53和其下游的信号通路发挥抗氧化应激作用[6-7]。mdm2是p53的靶基因，可与p53形成负反馈环路，因此也是p53信号通路中最重要的调控因子。研究发现，正常情况下，细胞内的mdm2/p53比值相对保持稳定，损伤后给予mdm2抑制剂(Nutlin-3)可显著下调mdm2表达，从而阻断p53泛素化降解、促进p53转录因子活性和p53介导的多种信号通路活化，最终导致机体发生氧化应激、炎症等多种病理损伤[7,12]。目前，在离体细胞实验中已证实糖氧剥离可干扰脊髓神经元内p53和mdm2平衡，促进p53在核内累积，引起神经元发生脂质过氧化反应[6]。针对负反馈环路，本研究也同样发现IPC可通过增加mdm2的表达、抑制p53活性，改善大鼠后肢运动和反射功能。值得注意的是，mdm2是一种核蛋白，在癌细胞中给予Nutlin-3治疗，也可明显抑制p53-mdm2之间的相互作用，通过增强p53稳定和胞内聚集影响肿瘤的转归[13]。综上所述，IPC可以通过激活p53负反馈通路，在SCIRI中发挥神经保护作用，然而这仅仅是众多保护机制中的一个环节，探寻能够针对多因素综合干预的药物或方法才能获得理想的治疗效果。