补阳还五颗粒质量标准研究

崔亚玲，胡 北，姚 东，薄桂宇，许子华

0 引言

补阳还五汤源自于清代王清任之《医林改错》，配方为黄芪、当归尾、赤芍、地龙、川芎、红花、桃仁7味中药，主要用于治疗中风后出现的半身不遂，口歪眼斜，嘴角流涎，小便次数增加或尿失禁，舌头暗淡，舌苔变白，脉缓无力。临床常用于心脑血管意外出现的后遗症、小儿麻痹后遗症及冠心病的治疗。同样适用于由其他原因引发的偏瘫、截瘫、单侧上肢/下肢萎软等气虚血淤者。临床应用多年，疗效确切，现根据临床需要研制成医院颗粒制剂。本研究采用薄层色谱法对处方中黄芪、赤芍及地龙药材进行了定性鉴别，采用HPLC-蒸发光检测法对黄芪中黄芪甲苷进行定量，方法操作简单、结果准确、专属性强，可作为该制剂的质量控制标准。

1 仪器与试药

1.1 仪器 高效液相色谱仪(岛津L-16)；蒸发光散色检测器(MODEL 100，美国索福特公司)；紫外线分析灯85-52015(德国Heraeus公司)；电子分析天平160 g/0.1(北京岛津公司)；电子分析天平120 D(北京岛津公司)；电热恒温二孔水浴锅(天津泰斯特公司)。

1.2 试药 黄芪甲苷对照品(批号：110781-201616)，地龙对照药材(批号：120987-201508)，赤芍对照药材(批号：121093-200402)，均购自中国食品药品检定研究院；乙腈(色谱纯，Sigma公司)，其他试剂均为分析纯；重蒸水(北部战区总医院自制)；硅胶G薄层板(青岛海洋化工有限公司)；补阳还五颗粒(规格：15 g/袋，北部战区总医院自制，批号：20180525、20180717、20180904)。

2 方法和结果

2.1 薄层鉴别方法

2.1.1 黄芪薄层鉴别 取补阳还五颗粒30 g，研细，加甲醇30 ml，加热回流1 h，滤液水浴加热蒸干，残渣加水20 ml溶解，用乙醚20 ml/次，洗涤2次，弃去乙醚层，水层用水饱和正丁醇溶液20 ml/次，萃取3次，合并萃取液，用20 ml氨水洗涤4次，取正丁醇层水浴蒸干，加甲醇1 ml使溶解，得供试品溶液[1-2]。除黄芪外，取按处方比例的其他药材，按照制备工艺制备颗粒，按上述制备供试品溶液方法制得阴性样品溶液。另取黄芪甲苷对照品，加入甲醇，制成1 mg/ml的对照品溶液。照薄层色谱法[3]，吸取供试品和阴性溶液各5 μl、对照品2 μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以二氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水(7.5∶20∶11∶5)的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干。喷以10%硫酸乙醇溶液，105 ℃温度下加热至斑点清晰。3批供试品色谱中，在与黄芪甲苷对照品色谱相对应的位置上，显示相同颜色的斑点，阴性对照无干扰。见图1。(实验条件：T 25 ℃，RH 65%)。

图1 黄芪薄层色谱鉴别

2.1.2 地龙薄层鉴别 取补阳还五颗粒50 g，研细，加二氯甲烷100 ml，加热回流40 min，滤过，滤液水浴加热蒸干，残渣加二氯甲烷0.5 ml使溶解，作为供试品溶液。除地龙外，取按处方比例的其他药材，按照制备工艺制备颗粒，按上述制备供试品溶液方法制得阴性样品溶液。另取地龙对照药材1 g，同法制得对照药材溶液。按照薄层色谱法[3]，吸取上述3种溶液各5 μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-丙酮(9∶1)为展开剂，展开，取出，晾干。置紫外光灯(365 nm)下检视[4]。3批供试品色谱中，在与对照药材色谱相对应的位置上，显示相同颜色的荧光斑点，阴性对照无干扰。见图2。(实验条件：T 25 ℃，RH 65%)。

2.1.3 赤芍薄层鉴别 取补阳还五颗粒30 g，研细，加乙醇30 ml，超声处理20 min，滤过，滤液水浴加热蒸干，残渣加水20 ml微热使溶解，用水饱和正丁醇20 ml/次，洗涤3次，合并正丁醇层溶液，蒸干，残渣加乙醇1 ml使溶解，作为供试品溶液。除赤芍外，取按处方比例的其他药材，按照制备工艺制备颗粒，按上述制备供试品溶液方法制得阴性样品溶液。另取赤芍对照药材1 g，同法制得对照药材溶液。照薄层色谱法[3]，吸取上述3种溶液各10 μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以二氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(40∶5∶10∶0.2)为展开剂，展开，取出，晾干。喷以5%香草醛硫酸溶液，105 ℃温度下加热至斑点清晰[5]。3批供试品色谱中，在与对照药材色谱相对应的位置上，显示相同颜色的斑点，阴性对照无干扰。见图3。(实验条件：T 25 ℃，RH 65%)。

图2 地龙的薄层色谱鉴别

图3 地龙的薄层色谱鉴别

2.2 含量测定

2.2.1 色谱条件 C18色谱柱(Diamonsil，4.6 mm×200 mm,5 μm)；以乙腈-水(32∶68)作为流动相；检测器为蒸发光散射检测器；流速：1 ml/min。理论板数按黄芪甲苷峰计算不小于4 000。

2.2.2 对照品溶液的制备 精密称定黄芪甲苷对照品适量，加甲醇制成浓度为0.4 mg/ml的对照品溶液。

2.2.3 供试品溶液的制备 取装量差异项下的本品，混匀，取适量，研细，取约15 g，精密称定，精密加甲醇100 ml，加热回流1 h，提取液回收溶剂并浓缩至干，残渣加水20 ml，微热溶解，40 ml/次水饱和正丁醇萃取4次，合并正丁醇层溶液，采用40 ml/次氨试液洗涤2次，取正丁醇液蒸干，残渣用适量甲醇溶解，转移至10 ml容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，微孔滤膜滤过，取续滤液，即得[6-8]。

2.2.4 阴性样品溶液的制备 取“2.1.1”项黄芪阴性颗粒，按上述供试品溶液制备方法制得。

2.2.5 专属性试验 精密吸取黄芪阴性样品溶液、供试品溶液和对照品溶液各20 μl，按照色谱条件进行分析，测定结果见图4。结果表明，此法专属性良好。

图4 补阳还五颗粒液相色谱图

注：A.阴性溶液色谱图，B.黄芪甲苷对照品色谱图，C.供试品色谱图；1.黄芪甲苷

2.2.6 线性与范围 精密吸取20 μl质量浓度为50、100、200、400、800、1 600 μg/ml的对照品溶液，注入液相色谱仪，以进样量C(μg)的对数值为横坐标，峰面积的对数值为纵坐标，求得回归方程：Y=1.490 8X+4.529，r=0.999 6。表明黄芪甲苷在50～1 600 μg/ml范围与峰面积呈较好的线性关系。

2.2.7 精密度试验 按上述色谱条件，对照品溶液连续进样6次，每次20 μl，记录峰面积，测得RSD为2.12%(n=6)，表明仪器精密度良好。

2.2.8 稳定性试验、重复性试验和回收率试验 精密称取补阳还五颗粒15 g，按上述供试品溶液制备方法处理，根据色谱条件，分别测定样品放置0、2、4、6、8、12 h后黄芪甲苷的峰面积。测得RSD为2.26%(n=6)，表明供试品溶液在12 h内稳定。

精密称取补阳还五颗粒15 g(n=6)，按上述供试品溶液制备方法，根据色谱条件，测定每份样品中黄芪甲苷含量。结果表明，样品中黄芪甲苷平均含量为0.242 6 mg/g，RSD为2.53%(n=6)，此法重复性良好。

精密称取补阳还五颗粒7.5 g(n=6)，分别加入0.95 ml浓度为1.92 mg/ml的黄芪甲苷对照品溶液，按上述供试品溶液制备操作，测定样品中含量，计算各样品回收率，结果表明，黄芪甲苷平均回收率为101.01%，RSD为2.66%(n=6)，符合要求。结果见表1。

2.2.9 样品含量测定 取3批补阳还五颗粒样品(批号：20180525、20180717、20180904)，按照供试品溶液的制备方法和色谱条件依次操作分析，测定各自样品中黄芪甲苷的含量。结果3批样品中黄芪甲苷的含量分别为0.233 4、0.223 2、0.247 2 mg/g。

表1 回收率试验

3 讨论

3.1 补阳还五汤是中医古代典籍中的经典方，临床长期应用实践疗效确切。但汤剂需要临用现制、煎煮耗时较长、不易保存、不便携带；而颗粒剂能够提高中药材的利用率，使剂量准确、溶解迅速、便于吸收、起效快、无药残、口感好、携带保存方便、服用量小，故将补阳还五汤制成医院颗粒制剂，除成型工艺外，其余与传统汤剂基本一致，即以水为溶媒提取，以物理方法固液分离、浓缩、干燥、颗粒成型等工艺生产，使得中药颗粒药效物质与中药饮片水煎汤剂保持基本一致。同时又可根据辩证论治的原则，适当配伍“单味中药配方颗粒剂”，使之更符合病情的需要。

3.2 流动相选择 笔者分别考察了乙腈-水(32∶68)、乙腈-水(33∶67)、乙腈-水(34∶66)。流动相为乙腈-水(34∶66)、乙腈-水(33∶67)时分离度<1.5，且有很多杂峰干扰。当以乙腈-水(32∶68)为流动相时，峰形佳，分离度>1.5，表明黄芪甲苷分离效果较好，故选择以乙腈-水(32∶68)为流动相[9-11]。赤芍薄层鉴别中，参考2015版《中国药典》，展开剂含有三氯甲烷，而三氯甲烷毒性大，故选毒性较低的二氯甲烷，实验证明结果良好。