微波辅助法提取淡豆豉中的多糖

郭婕，李季平

（周口师范学院生命科学与农学学院，河南周口 466001）

淡豆豉是豆科植物大豆或黑豆成熟种子的发酵加工品，是我国的一种传统健康食品，也是常用的药食同源食物之一，可作为食品、保健食品的原料用于日常保健[1]，也可用于感冒、寒热头痛、烦虚不眠等病症的治疗[2-3]。王思齐等[4]认为淡豆豉发酵生产的差异化是导致淡豆豉的药性不同的主要原因。淡豆豉含大豆蛋白、维生素、多糖及大豆异黄酮等多种生物活性成分[5]。相关研究表明，淡豆豉多糖是淡豆豉中一种重要的生物活性成分，具有降血糖作用[6]，并对糖尿病小鼠的肾脏和胰腺有一定的修复作用[7]。如何有效地从淡豆豉中提取多糖，逐渐成为研究的焦点。因此，优化淡豆豉多糖的提取工艺具有重要的现实意义。

多糖提取的方法较多，较常用的是传统的热水浸提法，该法能够最大限度地保持多糖的结构和活性，但提取率低、耗时长[8]。微波提取是利用微波能提取多糖的一种新技术，与传统热水浸提法相比，具有短时、快速、提取率高等特性，还可有效保护功能成分[9-10]。本研究利用微波辅助法从淡豆豉中提取多糖，通过单因素实验研究料液比、微波处理时间、浸提温度及微波功率对淡豆豉多糖提取率的影响，并通过正交试验优化淡豆豉多糖的提取工艺，以提高淡豆豉多糖的提取率，为淡豆豉多糖的开发利用提供一定的参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

淡豆豉，购于同和堂大药房。

无水葡萄糖、氯仿、正丁醇、无水乙醇、苯酚（AR.重蒸后使用）、98%浓硫酸、乙醚、盐酸、三羟甲基氨基甲烷、邻苯三酚、邻二氮菲、硫酸亚铁铵及双氧水等，均为分析纯；实验用水为蒸馏水。

1.2 仪器与设备

高速万能粉碎机，北京科伟永兴仪器有限公司；实验室微波炉，南京杰全微波设备有限公司；SHB-III 循环水式真空泵，郑州欧卡仪器设备有限公司；荣华HH-2 数显恒温水浴锅，江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司；电热恒温鼓风干燥箱，上海一恒科学仪器有限公司；LD5-2A低速台式自动平衡离心机，北京医用离心机厂；Spectrumlab 22PC 分光光度计，上海棱光技术有限公司；AL204 电子天平，梅特勒-托利多仪器有限公司；R206B旋转蒸发器，上海申生科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 淡豆豉多糖提取工艺流程

提取工艺参考王婧杰等[11]提取紫椴花多糖的方法并略有改动。将干燥的淡豆豉粉粹过40 目筛。称取淡豆豉粉5 g，加蒸馏水浸泡0.5 h，微波提取两次，抽滤，合并提取液。在提取液中加入氯仿：正丁醇（5：1）混合液，充分摇匀，4 000 r/min 离心10 min，取上清液，用旋转蒸发仪浓缩至20 mL 左右。按照浓缩液：乙醇为1：3 的比例，在浓缩液中加入无水乙醇，搅拌均匀，静置12 h 过夜。4 000 r/min 离心15 min，取沉淀，加适量乙醚洗涤沉淀，置于干燥箱内低温烘干，加蒸馏水定容至100 mL，得淡豆豉多糖提取液。

1.3.2 葡萄糖标准液的配置

称取4 g 葡萄糖，加蒸馏水配成1 000 mL 的母液，加蒸馏水将母液稀释100 倍，即为40 μg/mL 的葡萄糖标准液。

1.3.3 葡萄糖标准曲线的绘制

标准曲线的绘制参考陈钧辉等[12]编著的生物化学实验教材并略有改动。分别移取0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9 mL 的40 μg/mL 葡萄糖标准溶液，置于各试管中，均加蒸馏水补至1 mL，然后各加入1 mL、6%苯酚溶液，摇匀，依次加入5 mL 浓硫酸，摇匀，置于40 ℃的水浴锅中保温30 min，冷却，于波长490 nm 处测定吸光度。将待测试管中葡萄糖的浓度（μg/mL）与吸光度作回归处理，制作标准曲线。得到回归方程：Y=0.186 6X＋0.029 2，R2=0.999 8。

1.3.4 淡豆豉多糖提取率的测定

取1 mL 稀释样品液，置于试管中，依照上述方法处理，于波长490 nm 处测定其吸光度。按照公式（1）计算淡豆豉中多糖的提取率（%）。

式中：c 为样品测定液多糖的浓度，μg/mL；V 为样品提取液的体积，mL；K 为样品测定液的稀释倍数；W 为原料的质量，g。

1.3.5 单因素试验

利用微波提取法，以多糖含量为指标，经单因素试验初步考察料液比、微波处理时间、浸提温度及微波功率四个因素对豆豉多糖提取率的影响。

1.3.6 正交试验优化

为了确定以上四个因素对淡豆豉多糖提取率的影响大小，在单因素试验的基础上采用L9(34)正交表进一步优化，确定淡豆豉多糖的最佳提取条件。因素水平设计见表1。

表1 正交试验因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 料液比的筛选

设置浸提温度为50 ℃，微波功率为300 W，微波处理2 min，研究不同料液比1：10、1：15、1：20、1：25、1：30（g：mL）对淡豆豉多糖提取率的影响，结果如图1 所示。由图1 可知，在一定范围内，随着提取溶剂的增加，淡豆豉多糖的提取率先升高后下降；料液比在1：20 时，淡豆豉多糖的提取率最高，为0.58%。提取剂过少时，多糖溶出量低；随着提取剂增加，细胞内外渗透压降低，当降低到一定程度时，会影响细胞内物质的迁移[13]；且提取剂过多，会相应增加浓缩时间，易导致糖链在高温下断裂，使得提取率下降。故料液比初步选择1：20。

图1 料液比对淡豆豉多糖提取率的影响Fig.1 Effect of solid-liquid ratio on the extraction yield of polysaccharide from semen sojae praeparatum

2.1.2 微波处理时间的筛选

设置料液比1：20，浸提温度50 ℃，微波功率300 W，研究不同微波处理时间1、2、3、4、5 min 对淡豆豉多糖提取率的影响，结果如图2 所示。由图2 可知，微波处理时间在5 min 之内，豆豉多糖提取率随时间增加先升高后下降；微波时间在3 min 时，多糖提取率最高，为0.71%。主要原因可能是短时间内微波辐射对细胞的破坏能力强，使有效成分的分子运动加剧，扩散速度增加，多糖溶出较多；但随着微波处理时间的延长，温度上升，多糖分子结构被破坏，含量也相应的减少，这与王娟等[14]的研究结果一致。故微波时间初步选择3 min。

图2 微波处理时间对淡豆豉多糖提取率的影响Fig.2 Effect of microwave-heating time on the extraction yield of polysaccharide from semen sojae praeparatum

2.1.3 浸提温度的筛选

设置料液比1：20，微波功率300 W，微波处理3 min，研究不同浸提温度50、60、70、80、90 ℃对淡豆豉多糖提取率的影响，结果如图3（见下页）所示。由图3 可知，浸提温度为70 ℃时，淡豆豉多糖的提取率最高，为0.83%。温度过低，溶剂的渗透能力和溶解能力不够，多糖不能有效溶出；但温度过高易造成溶液暴沸而溢出，不利于提取[15]，且还会使较多的杂质溶出，增加分离难度[16]。故浸提温度选择70 ℃。

2.1.4 微波功率的筛选

设置料液比1：20，浸提温度70 ℃，微波处理3 min，研究不同微波功率150、300、450、600、750 W 对淡豆豉多糖提取率的影响，结果如图4（见下页）所示。由图可知，在一定范围内，淡豆豉多糖提取率随着微波功率的增加先升高后下降，当微波功率达到450 W 时，多糖提取率达到最高，为0.95%。随着微波功率的增加，细胞的破坏程度加大，多糖提取率升高；但微波功率过大时，细胞的破碎至一定程度，反而对细胞内物质的选择加热差异减小，使多糖提取率下降[17]。故微波功率初步选择450 W。

图3 浸提温度对淡豆豉多糖提取率的影响Fig.3 Effect of temperature on the extraction yield of polysaccharide from semen sojae praeparatum

图4 微波功率对淡豆豉多糖提取率的影响Fig.4 Effect of microwave power on the extraction yield of polysaccharide from semen sojae praeparatum

2.2 正交试验结果

由正交试验结果（表2）极差分析可知，影响淡豆豉多糖提取率的因素主次顺序为B>A>D>C，即微波处理时间>料液比>微波功率>浸提温度。表3 显示了各因素对淡豆豉多糖提取率均有一定影响，其中微波处理时间表现显著（P<0.05）。淡豆豉多糖的最佳提取条件为A2B2C3D3，即料液比1：20（g：mL）、微波处理3 min、浸提温度为80 ℃、微波功率为600 W。为进一步验证上述结果，按照最佳提取工艺条件组合，重复3 次，进行验证试验，所得淡豆豉多糖的提取率分别为1.05%、1.01%、1.02%。故在最佳提取工艺条件下，淡豆豉多糖的提取率为1.03%±0.02%。

表2 L9(34)正交试验结果Table 2 Results of L9(34) orthogonal test

表3 提取率方差分析Table 3 Variance analysis of the extraction yield

3 结论

通过单因素及L9(34)正交试验，分析料液比、微波处理时间、浸提温度及微波功率对淡豆豉多糖提取率的影响，并优化最佳微波提取条件。经极差及方差分析可知，影响豆豉多糖提取率的因素主次顺序为微波处理时间>料液比>微波功率>浸提温度，其中微波处理时间的影响最大。淡豆豉多糖的最佳提取条件为料液比1：20（g：mL）、微波处理3 min、浸提温度为80 ℃、微波功率为600 W，在此条件下，豆豉多糖的提取率为1.03%±0.02%，为进一步研究豆豉中多糖的纯化、生物活性及产品开发提供理论参考。