安徽“粉性葛”与“柴性葛”中6种异黄酮类化合物含量比较

刘 毅，尹旻臻，徐 涛，段海燕，程铭恩

(1. 安庆医药高等专科学校，安徽 安庆 246052；2.安徽中医药大学药学院，安徽 合肥 230012)

葛根，始载于《神农本草经》，来源于豆科植物野葛Puerarialobata(Willd.) Ohwi的干燥根，具有解肌退热、透疹、生津止渴等功效[1-2]。据文献报道，葛根中含有丰富的异黄酮类化合物[3-4]，具有很好的扩张冠状动脉，降低心肌耗氧量等药理活性[4-8]。安徽省是葛根的主产区之一[9]，尤以大别山区和皖南山区产量大[10]。有文献报道不同产地的葛根品质存在较大差异[11-13]，其中安徽省不同产地的葛根中异黄酮化合物含量差异也较大。在产地调查过程中，发现葛根存在两种类型。一种葛的根系庞大，块根扭曲，形状不规则，纤维较多，药农称之为“柴性葛”；另一种葛的块根分枝少，常呈纺锤形，粉性较强，药农称之为“粉性葛”[14]。其中“粉性葛”并非是粉葛，而是野葛中粉性较强的类型。药农认为“粉性根”质量较差，而葛根的性状与其质量的相关性尚不清楚，有必要对“粉性葛”与“柴性葛”进行质量评价。

本研究采用高效液相色谱法同时测定葛根中3′-羟基葛根素、葛根素、3′-甲氧基葛根素、葛根素芹菜糖苷、大豆苷、大豆苷元的含量，比较安徽省“粉性葛”与“柴性葛”中这6种成分的含量，为安徽地区葛根品质评价和资源利用提供科学依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Agilent 1260高效液相色谱仪(真空脱气装置、二元泵、ALS、TCC、DAD和Chemstation 工作站)：Agilent公司；Agilent Zorbax XDB-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，3.5 μm)：美国Agilent公司；BP211D电子天平：德国Startorius公司；恒温烘箱：上海精宏实验设备有限公司；杰瑞尔HH-6数显恒温水浴锅：浙江金坛市杰瑞尔电器有限公司；Milli-Q超纯水仪：美国Merck Millipore公司。

1.2 试药 3′-羟基葛根素(批号 CFN90236，纯度≥98%)、葛根素(批号 CFN99169，纯度≥98%)、3′-甲氧基葛根素(批号 CFN90780，纯度≥98%)、大豆苷(批号 CFN99101，纯度≥98%)、大豆苷元(批号 CFN98774，纯度≥98%)：武汉天植生物技术有限公司；葛根素芹菜糖苷(批号 G-021-161019，纯度≥98%)：成都瑞芬斯生物科技有限公司；甲醇(色谱纯)：美国TEDIA公司。

葛根药材于2016年12月采集，共26批样品，经安徽中医药大学彭华胜教授鉴定为豆科植物野葛[Puerarialobata(Willd.) Ohwi]的根。选取采挖葛根的粗大部位，45 ℃烘干至恒质量，粉碎，过3号筛，干燥保存。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 采用Agilent Zorbax XDB-C18(250 mm×4.6 mm，3.5 μm)色谱柱，柱温30 ℃，以甲醇(A)-0.2%醋酸水(B)为流动相，梯度洗脱(0～25 min，23% A；25～35 min，23% A→40% A；35～48 min，40% A→65% A；48～50 min，65% A→23% A)，流速0.8 mL/min；检测波长250 nm，进样量10 μL。对照品与样品色谱峰见图1。

注:1. 3′-羟基葛根素;2.葛根素;3. 3′-甲氧基葛根素;4.葛根素芹菜糖苷;5.大豆苷;6.大豆苷元图1 样品(A)和对照品(B)的高效液相色谱图

2.2 对照品及供试品溶液的制备

2.2.1 混合对照品溶液的制备 以50%甲醇制备3′-羟基葛根素0.080 mg/mL、葛根素0.16 mg/mL、3′-甲氧基葛根素0.040 mg/mL、葛根素芹菜糖苷0.040 mg/mL、大豆苷0.040 mg/mL、大豆苷元0.005 mg/mL混合溶液，即得。

2.2.2 供试品溶液制备 精密称取葛根样品粉末0.1 g，加30%乙醇25 mL，静置30 min，称量，加热回流30 min，冷却至室温，再次称质量，用30%乙醇水溶液补足减失的量，取上清液，0.45 μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

2.3 方法学考察

2.3.1 线性关系考察 取“2.2.1”项下各混合对照品溶液，以50%甲醇分别稀释成1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、1/64、1/128、1/256浓度混合对照品溶液，按“2.1”项分别进样30 μL注入液相色谱仪，测定其峰面积。分别以3′-羟基葛根素、葛根素、3′-甲氧基葛根素、葛根素芹菜糖苷、大豆苷、大豆苷元的浓度(mg/mL)为横坐标(ρ)，峰面积积分值为纵坐标(A)，构建峰面积与含量的关系，得线性回归方程见表1。

表1 各成分的线性范围、回归方程和相关系数

2.3.2 精密度试验 精密吸取同一对照品溶液，连续进样分析6次，进样量10 μL，记录色谱图。测得3′-羟基葛根素、葛根素、3′-甲氧基葛根素、葛根素芹菜糖苷、大豆苷、大豆苷元峰面积的RSD分别为1.40%、0.22%、1.84%、0.66%、0.53%、1.79%，表明仪器精密度良好。

2.3.3 重复性试验 按“2.2”项方法制备6份供试品溶液，分别进样10 μL；测得3′-羟基葛根素、葛根素、3′-甲氧基葛根素、葛根素芹菜糖苷、大豆苷、大豆苷元的平均含量分别为1.60、8.95、1.59、1.94、1.84、0.09 mg/g，含量的RSD分别为1.98%、1.55%、1.65%、1.54%、1.84%、2.05%，表明方法重复性良好。

2.3.4 稳定性实验 按“2.2”项方法制备1份供试品溶液，分别于0、2、4、8、12、24 h进样10 μL，测得3′-羟基葛根素、葛根素、3′-甲氧基葛根素、葛根素芹菜糖苷、大豆苷、大豆苷元峰面积值RSD分别为0.28%、0.43%、0.52%、0.14%、0.33%、1.23%，表明样品溶液在24 h内稳定性良好。

2.3.5 加样回收率试验 取已知含量的葛根样品粉末(3′-羟基葛根素1.79%、葛根素4.83%、3′-甲氧基葛根素2.28%、葛根素芹菜糖苷1.31%、大豆苷1.32%、大豆苷元0.02%)0.1 g，平行称取6份，加入一定量的混合对照品溶液，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下方法测定，分别计算各组分加样回收率[回收率=(实际测得含量-样品中含量)/对照品加入量×100%]，并计算平均值。3′-羟基葛根素、葛根素、3′-甲氧基葛根素、葛根素芹菜糖苷、大豆苷、大豆苷元平均回收率分别为98.6%、103.4%、98.5%、102.1%、105.9%、100.7%，表明该实验方法具有良好的加样回收率。

2.4 样品含量测定 取不同性状的葛根样品粉末0.1 g，精密称定，分别按“2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定，测定混合对照品溶液和供试品溶液，分别记录3′-羟基葛根素、葛根素、3′-甲氧基葛根素、葛根素芹菜糖苷、大豆苷、大豆苷元的峰面积，运用外标法计算其干燥品中含量。结果见表2。

表2 “粉性葛”与“柴性葛”中6种异黄酮含量测定结果

注：“*”表示粉性葛根，空白单元格表示未测出含量

2.5 主成分分析 运用IBM SPSS 19.0统计分析软件，对不同性状葛根中6种异黄酮化合物做主成分分析。分析结果表明，主成分1特征值为4.20，方差贡献率为59.99%，主成分2特征值为1.17，方差贡献率为16.72%，主成分1与主成分2累计贡献率为75.25%，表明主成分1和主成分2代表了15个产地的大部分信息。以两个主成分得分做散点图，见图2。结果显示主成分分析能分别将AHNG-2、AHQY、AHNG-3、ANTL、AHNG-1、AHTH-1、AHTH-2、AHSS、AHWJ等聚为一类。

2.6 聚类分析 运用IBM SPSS 22.0统计分析软件，“粉性葛”与“柴性葛”样品中6种异黄酮化合物的含量运用欧式距离平方计算样品间相似系数，运用Ward法聚类分析，建立系统聚类树。由图3可知，当距离介于12.50～25.00时，可以将26个批次分为2类，AHNG-2、AHQY、AHNG-3、ANTL、AHNG-1、AHTH-1、AHTH-2、AHSS、AHWJ为第一类，AHDZ-3、AHYXQ-2、AHYXQ-1、AHYX、AHST-1、AHST-2、AHZY、AHDZ-1、AHQM-2、AHHS-2、AHQM-1、AHGM-2、AHGM-3、AHDZ-2、AHTC、AHJX、AHMG-1为第二类。因此2类得以区分。从聚类分析结果可以看出其与主成分分析结果具有一致性。

图2 “粉性葛”与“柴性葛”中6种异黄酮含量主成分分析图

图3 聚类分析树状图

3 讨论

3.1 提取条件的优化 本研究对超声波提取法与加热回流提取法进行了比较，结果表明加热回流提取法所得的异黄酮类成分提取率较高，故选用加热回流提取法。本实验同时考察了不同提取溶剂、不同料液比、不同提取时间，发现以30%乙醇溶液为提取溶剂，采用250倍量，加热回流30 min，可充分将异黄酮类成分提取，说明该提取条件简便、合理、可行。

3.2 检测波长的选择 取3′-羟基葛根素、葛根素、3′-甲氧基葛根素、葛根素芹菜糖苷、大豆苷、大豆苷元的对照品溶液，用紫外分光光度计测定，于190～400 nm波长范围内扫描，结果6种异黄酮成分在250 nm处有最大吸收。因此，将检测波长设定为250 nm。

3.3 流动相的选择 对甲醇-0.1%醋酸水、甲醇-0.2%醋酸水、甲醇-0.5%醋酸水的流动相系统进行考察，结果表明，甲醇-0.2%醋酸水能达到分离度的要求，分离时间合适，最后确定流动相为甲醇(A)-0.2%醋酸水(B)，梯度洗脱(0～25 min，23% A；25～35 min，23% A→40% A；35～48 min，40% A→65% A；48～50 min，65% A～23% A)。

3.4 样品测定结果分析 实验结果表明，安徽省不同产地之间葛根中各成分含量差异较大。实验中所测定的15个产地的葛根样品存在两种性状类型：一种纤维性较强，当地药农称之为“柴性葛”；另一种粉性较强，当地称之为“粉性葛”。“柴性葛”与“粉性葛”均来自豆科植物野葛[Puerarialobata(Willd.) Ohwi]，仅在根的粉性强弱上有差异。“粉性葛”的粉性明显较“柴性葛”高，且多为短粗的纺锤形，性状上易与“柴性葛”区分。

安徽省15个产地中，产于安徽宁国、青阳、太湖、铜陵、望江、宿松的葛根为“粉性葛”类型，异黄酮类成分含量较低，其葛根素含量低于《中华人民共和国药典》规定的2.40%。同为“柴性葛”的类型中，其不同产地“柴性葛”异黄酮含量亦有明显差异，如安徽明光地区的葛根中葛根素含量约8.11%，而安徽宿松地区的葛根中葛根素含量约0.52%，其差异可能受产地因素影响。基于含量测定结果，采用主成分分析和聚类分析对“粉性葛”与“柴性葛”进行分析，结果表明“粉性葛”与“柴性葛”可以在含量成分上进行区分。因此在临床用药时除了需要关注葛根的产地，同时需要关注葛根的性状。

葛根为药食两用中药，由于葛根的需求量巨大，野生资源逐渐减少。考虑到“柴性葛”与“粉性葛”不仅粉性上有差异，其所含的异黄酮化合物含量也有明显差异。因此建议食用葛根时应选“粉性葛”，以合理利用其根中丰富的淀粉[15]，而药用的葛根应选用“柴性葛”，以充分利用其丰富的异黄酮化合物含量。