丹参注射液对格列喹酮在糖尿病大鼠体内药物代谢动力学参数和肠吸收特性的影响

李梦颖 ，张 瑞，杨 晔，2，邵福平，徐慧慧，尹登科，2，3

(1.安徽中医药大学药学院，安徽 合肥 230012；2.安徽省中医药科学院药物制剂研究所， 安徽 合肥 230012；3.中药复方安徽省重点实验室，安徽 合肥 230012)

格列喹酮作为第二代磺脲类口服降糖药物，因口服吸收快、作用时间短的特点而在临床上被广泛使用，但是临床上存在低血糖发生的风险[1]。丹参因其活血化瘀、祛瘀止痛之功效常用于血瘀证[2]的治疗。丹参注射液和格列喹酮在临床上常用于糖尿病及其并发症的治疗，但是丹参注射液对格列喹酮药物代谢动力学参数是否有影响尚不清楚。本研究考察了丹参注射液对格列喹酮在糖尿病大鼠体内血药浓度的影响，建立原位在体肠循环动物模型研究丹参注射液对格列喹酮在糖尿病大鼠体内肠吸收的影响，观察丹参注射液对格列喹酮药物代谢动力学参数及肠吸收特性的影响，为今后两药的临床合用提供依据。

1 材料

1.1 试剂 丹参注射液(批号 1705083)：上海中西制药有限公司；格列喹酮标准品(批号 D07F6J1)：上海源叶生物科技有限公司；链脲佐菌素(streptozotocin，STZ；批号 EZ2921B400)：美国Sigma公司；格列喹酮片(糖适平，批号 1140637)：北京万辉双鹤药业有限责任公司；甲醇、乙腈(色谱纯)：天津市大茂化学试剂厂；水为Mill-Q超纯水；其余试剂均为分析纯。

1.2 仪器 Hypersil BDS C18色谱柱：大连依利特公司；Wsters 1529高效液相色谱仪：美国Waters公司；220-A型数显电热恒温干燥箱：上海阳光实验仪器有限公司；KQ2200型超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；TG16-WS台式高速离心机：长沙湘仪离心机仪器有限公司；ZXZ-Z型循环水式真空泵：河南一恒仪器有限公司。

1.3 动物 健康SD大鼠20只，雌雄不限，SPF级，饲养环境温度为18～26 ℃，月龄1～2个月，体质量(220±10)g，由安徽医科大学实验动物中心[动物生产许可证号：SCXK(皖)2017-001；动物使用许可证号：SYXK(皖)2017-006]提供。

2 方法

2.1 糖尿病大鼠模型的制备 所有动物适应性喂养1周后，模型复制前禁食12 h(一般过夜禁食，不禁水)，STZ按每千克体质量65 mg的剂量一次性腹腔注射，临用前用枸橼酸缓冲液(0.1 mol/L，pH 4.5)配制。72 h后检测空腹血糖，空腹血糖浓度>16.6 mmol/L即为模型复制成功。

2.2 色谱条件 按照文献[3]确定色谱条件。Hypersil BDS C18(4.6 mm×200 mm，5 μm)；流动相：乙腈-水(65∶35)，过滤并脱气；流速：1.0 mL/min；检测波长：294 nm；柱温：25 ℃；进样量：20 μL。

2.3 样品的处理方法 精密吸取大鼠血浆200 μL，加入1 mL二氯甲烷，涡旋混匀2 min后，4 000 r/min离心10 min，取二氯甲烷层，50 ℃氮气吹干， 加入200 μL甲醇复溶，涡旋混匀2 min，12 000 r/min离心10 min后，取上清液20 μL进样。

精密吸取人工肠液样品(Tyrode液)[4]200 μL，加入1 mL二氯甲烷，涡旋混匀2 min后，4 000 r/min离心10 min，取二氯甲烷层，50 ℃氮气吹干，加入200 μL流动相复溶，涡旋混匀2 min，12 000 r/min 离心10 min 后，取上清液20 μL进样。

2.4 药物代谢动力学研究 选取12只糖尿病大鼠，随机分为格列喹酮组和丹参-格列喹酮组。格列喹酮组单独灌胃给予15 mg/kg(按照人与大鼠等效剂量比值6倍换算，相当于药品说明书建议成人每日临床剂量 2.5 mg/kg)的格列喹酮混悬水溶液；丹参-格列喹酮组先腹腔注射2 mL/kg(药品说明书建议成人每日临床剂量0.5 g/kg)的丹参注射液5 min后，灌胃给予15 mg/kg的格列喹酮混悬水溶液。两组均在给予格列喹酮后0.5、1、1.5、2、2.5、3、4、6、8 h经眼眶取血0.3 mL血样，所取血样分别置于1.5 mL涂有肝素钠的微型离心管中，静置30 min后，在4 000 r/min下离心10 min，取上层血浆200 μL，按“2.3”项下操作，记录峰面积，计算血药浓度，并绘制平均血药浓度-时间曲线图。

2.5 肠吸收实验 按文献[5]的方法，将糖尿病SD大鼠(禁食12 h、自由饮水)随机分为两组(格列喹酮组和丹参-格列喹酮组)，每组4只，称质量后腹腔注射10%水合氯醛(3.5 mL/kg)，麻醉后固定并维持体温，沿腹中线打开腹腔，暴露小肠，两组大鼠均选取全肠段(选取肠段标准如下：十二指肠自幽门1 cm处开始向下，盲肠上行10 cm止)，肠段两端切口，用预热至37 ℃的生理盐水将肠内容物冲洗干净，切口两端分别插管，结扎固定。伤口处用浸有生理盐水脱脂棉覆盖保湿，保温37 ℃。以10 μg/mL格列喹酮-Tyrode灌注液40 mL进行肠循环灌注，流速为0.2 mL/min，待灌注液充满整个循环通路时记为0时刻，循环灌注180 min后结束，期间每隔20 min取循环液1 mL并检测其中格列喹酮含量。丹参-格列喹酮组在10 μg/mL格列喹酮-Tyrode液灌注前5 min，经尾静脉注射丹参注射液(2 mL/kg)，再按上述方法进行实验，两组均设置空白大鼠对照。实验结束后测定小肠剩余药量x，根据小肠剩余药量的对数(lnx)对取样时间t作图，求得速率常数(rate constant，Ka)，计算表观渗透系数(apparent permeablility coefficient， Papp)。计算公式如下[4-5]：

lnx=lnx0-Kat

其中x0为灌注液中的药物初始量，A为小肠吸收面积。

3 结果

3.1 丹参注射液对格列喹酮在糖尿病大鼠体内血药浓度的影响 格列喹酮单独灌胃以及与丹参注射液合用后其药物代谢动力学过程在糖尿病大鼠体内均符合一室模型。药-时曲线见图1，药物代谢动力学参数见表1。结果表明，在与丹参注射液合用后，格列喹酮在糖尿病大鼠体内的药物代谢动力学参数发生了显著的改变。达峰时间从2.70 h缩短到了2.08 h；最大药物浓度从6.35 μg/mL增加到了24.14 μg/mL，大约提高了3.8倍，差异有统计学意义(P<0.05)；药-时曲线下面积从37.35 mg/(L·h)提高至89.42 mg/(L·h)，差异有统计学意义(P<0.05)；并且清除率大约缩小了2倍，差异有统计学意义(P<0.05)。

图1 丹参注射液对格列喹酮在糖尿病大鼠体内

3.2 丹参注射液对格列喹酮在糖尿病大鼠肠内吸收的影响 丹参注射液对格列喹酮肠吸收特性见表2。与格列喹酮组相比，丹参-格列喹酮组的吸收速率Ka从(8.53±1.29)×10-3/s增加到(21.39±7.47)×10-3/s；Papp从(1.82±0.22)×10-8cm/s增加到(4.35±1.35)×10-8cm/s；丹参-格列喹酮组的Ka和Papp值显著增加，差异有统计学意义(P<0.05)。这表明丹参注射液可以促进格列喹酮在糖尿病大鼠体内的吸收。

4 讨论

格列喹酮与丹参注射液合用后能显著增加格列喹酮的cmax、AUC，显著缩短tmax，显著减少Cl。丹参注射液可以显著增加格列喹酮在糖尿病大鼠体内的Ka和Papp。这可能是丹参中某些成分影响格列喹酮的吸收、分布、代谢和排泄过程。肠道外排载体和血流速度可能是影响药物口服吸收的因素。有研究表明，丹参酮Ⅰ为丹参的有效成分之一，可以抑制以地高辛为底物的P-糖蛋白(P-glyocprotein，P-gp)转运[8]。笔者推测，丹参中某些成分可能通过抑制P-gp而影响格列喹酮的吸收和转运过程。丹参具有活血的作用，丹参的主要成分丹参酮ⅡA能通过抑制一氧化氮合成酶和提高细胞色素P450代谢产物，引起血管的舒张，从而加快血液流动[9]，丹参素A和隐丹参酮以及二氢丹参酮同样有着扩张血管的作用[10]，扩张血管、加快血液流动可能是丹参注射剂影响格列喹酮肠道吸收的原因之一。格列喹酮在大鼠和人的体内主要由CYP2C系列的肝药酶代谢，其他涉及的酶还有CYP3A、CYP2D、CYP1A和CYP2E系列的酶[11-12]。而丹参中活性成分隐丹参酮不仅可以竞争性抑制肝微粒体的CYP1A2和CYP2C9，还可以非竞争性地抑制CYP3A4酶的活性；丹参酮可以抑制肝药酶CYP1A2、CYP2C6和CYP2C11的活性，并且丹参酮ⅡA可显著抑制CYP2C19的活性[13-14]；丹参的乙醇提取物是CYP1A2 酶的强抑制剂，是CYP3A4/5的中等强度抑制剂[15]。因此，丹参可能通过抑制一个或多个肝微粒体酶，从而抑制格列喹酮在肝脏内的代谢，进而影响格列喹酮在大鼠体内的血药浓度，改变其药物代谢动力学过程。

表1 丹参注射液对格列喹酮药物代谢动力学参数的影响

注：与格列喹酮组相比，*P<0.05；t1/2(half-life)：半衰期；tmax(time to peak)：达峰时间；cmax(peak concentration)：最大血药浓度；Cl(clearance)：清除率；AUC(area under curve)：血药浓度-时间曲线下面积

表2 丹参注射液对格列喹酮在糖尿病大鼠体内肠吸收特性的影响

注：与格列喹酮组比较，*P<0.05

综上所述，丹参注射液和格列喹酮合用可以显著提高糖尿病大鼠格列喹酮的血药浓度和生物利用度，其原因可能与丹参注射液促进格列喹酮的小肠吸收相关，提示临床上丹参注射液与格列喹酮联合用药时格列喹酮用量需适当调整，以免发生不良反应。