常见动物原虫病的显微镜快速检查方法

2019-10-14 02:53朱石琼鲁富有解明华刘桂伶张容萍陈俊秀彭海生

养殖与饲料 2019年10期

朱石琼鲁富有解明华刘桂伶张容萍陈俊秀彭海生

1.云南省普洱市宁洱县勐先镇农业综合服务中心，云南普洱 665104；2.云南省普洱市动物疫病预防控制中心，云南普洱 665000；3.云南省普洱市宁洱县动物疫病预防控制中心，云南普洱 665199；4.云南省普洱市景谷县动物疫病预防控制中心，云南普洱 666400

动物原虫病比较繁多，分布十分广泛，特别是血液原虫病、球虫病和附红细胞体病（现列为立克次氏体），对畜禽养殖业危害极大。近年来，此类疫病的发病呈上升趋势，部分病已呈局部流行。特别是猪、牛、马、羊的焦虫病，呈急性或慢性消耗性发病死亡，给广大养殖户造成了很大损失。近年来，笔者采用显微镜快速检查诊断方法，结合流行病学等综合分析，对10多例的动物原虫病作出诊治，为广大养殖户挽回了经济损失。

1 原虫

1.1 形态结构

原虫是单细胞动物，整个虫体由1个细胞构成。分类上属于原生生物界，原生动物亚界。同高等动物的细胞一样，原虫具有细胞膜、细胞质和细胞核等主要细胞结构。

在光电显微镜下，原虫细胞核外表变化很大，除纤毛虫外，大多数均为囊泡状，其特征为染色质分布不均匀，在核液中出现明显的清亮区，染色质浓缩于细胞核的周围区域或中央区域。有1个或多个核仁。核内体明显，与核仁相似，但在有丝分裂过程中不消失。

原虫有4种运动器官：鞭毛、纤毛、伪足和波动嵴。鞭毛很细，呈鞭子状，鞭毛的大部分可能包埋在虫体一侧延伸出来的细胞膜中，从而形成一个鳍状波动膜，如伊氏锥虫；纤毛的结构与鞭毛相似，但数目更多；伪足是肉足鞭毛亚门虫体的临时性器官，可以引起虫体运动以捕获食物；波动嵴是孢子虫定位的器官，只有在电镜下才能观察到。此外，原生动物还有一些特殊细胞器，即动基体和顶复合器。

1.2 生殖方式

原虫的生殖方式分无性生殖和有性生殖2种。

1）无性生殖。二分裂生殖：即1个虫体分裂为2个，分裂方式有纵二分裂和横二分裂。裂殖生殖：也称复分裂，细胞核和基本细胞器先分裂数次，而后细胞质分裂、同时产生大量子代细胞。裂殖生殖中的虫体称为裂殖体，1个裂殖体内可包含数十个裂殖子。孢子生殖：是配子形成的合子所进行的复分裂，经孢子生殖、孢子体可以形成多个子孢子。出芽生殖：即先从母细胞边缘或细胞内分裂出1个或数个小的子个体，逐渐变大成单独个体。

2）有性生殖。有结合生殖和配子生殖2种基本类型。结合生殖：多见于纤毛虫，2个虫体并排结合，进行核质的交换，核重建后再分裂为含有新核的虫体。配子生殖：因为虫体在裂殖生殖过程中出现性的分化，一部分裂殖体形成大配子体（雌性），一部分形成小配子体（雄性）。1个小配子体发育成熟后可以产生多个小配子，1个大配子体只产生1个大配子。小配子进入大配子体内结合形成合子，合子可以再进行孢子生殖。

1.3 宿主与寄生部位

绝大多数动物原虫病（住肉孢子虫除外）是由各种不同的原虫寄生于各种动物细胞或造血器官引起的。其宿主可以有1个或2个（如球虫）。原虫的中间宿主以蜱螨和吸血昆虫为主，如螫蝇、蠓、蚋、虻、虱等。

1.4 虫体大小及检查

1）虫体大小。引起动物发病的原虫十分微小，大小0.2～20.0 μm，人的肉眼不能直接观察到，必须借助光学显微镜或电子显微镜将其放大后，才能观察到虫体或其虫卵的形态和结构。普通光电显微镜，可以将血原虫或细菌放大至1 000倍（100倍物镜和10倍目镜联合放大），达到0.2～2.0 mm后，肉眼可以观察。血液原虫一般为无色半透明，经过染色后可在显微镜下清晰观察到其形态结构。

2）原虫的快速检查。主要是采取血液（或胸腹腔液、粪便处物）涂片染色镜检。临床上较常用的有革兰氏染色、瑞特氏染色、姬姆萨染色、美蓝染色等。血液涂片染色镜检适用于血孢子虫引起的寄生虫病，如猪、牛、羊、马、犬焦虫，牛、马、羊伊低锥虫，多种动物附红细胞体（属立克次氏体）；弓形虫采取胸腹腔积液涂片或病料触片染色镜检；球虫可采集病变部位肠内粪便处理后的漂浮物，涂片检查球虫卵。采取相应的样品涂片染色和显微镜检，可以简单、快速和准确地诊断动物原虫病，在临床诊断上具有重要意义。

2 检查样品涂片的制作

2.1 玻片要求

载玻片的大小、厚度等参数要符合国家标准。玻片要求完好无缺损，新开封的玻片不用清洗，使用时在酒精灯火焰上来回烘烤一下，以除去玻片上的水分和部分有机质，使玻片干燥透亮。旧玻片要用清洁剂清洗干净并干燥后使用，使用前最好也用酒精棉球火焰烘烤一下。

2.2 样品检查步骤

清洁干燥玻片→血液（病料）涂片→自然干燥→甲醇（或火焰）固定→涂片染色（有的可不染色）→显微镜检→显微图片采集→记录。

2.3 样品的采集

血液涂片应当采自于活体或濒死期动物末稍血液或静脉血，死亡时间较长的血液检出率会降低，或因虫体死亡或自溶而不能检出。胸腹腔液采于致死或死亡时间很短的动物体腔。发病后未经治疗的动物检出率更高。采样时必须注意，现场不能涂片的可用EDTA抗凝管，或用EDTA-K2抗凝管采集末稍血或静脉血，冷藏保存，稍后涂片。

2.4 病料涂片制作

1）组织病料涂片或触片：尽量在无菌条件下剪开新鲜的组织病料，轻轻触片或涂在干燥、洁净的玻片中央，编号后使之自然干燥，备用。

2）血液涂片：用吸管或移液器现场采集发病动物的新鲜全血，或用EDTA、或EDTA-K2抗凝管采集保存的抗凝血少许（5～10 μL），于洁净玻片近端约1/3的中央，用另一玻片一端约45°向前推约2 cm，即成血液涂片，使之自然干燥，备用。临床实践中，在现场用玻片的一角，直接蘸取末稍血（或适检血）一小滴，于玻片近端1/3处，玻片斜偏使血液成一直线后，于30°～45°向前推约2 cm即成。同一待检血样要同时制作血片3～5片备用，并做好编号。

3）胸腹腔液涂片制作：如弓形虫的包囊、滋养体检查，用无菌微量吸管或注射器，吸取胸腹腔液于玻片中央，轻轻涂抹均匀，形成薄膜，使之自然干燥，备用。

4）球虫及虫卵检查涂片制作：急性死亡病例可从病变部位刮取少量黏膜置于载玻片上，加1～2滴生理盐水混匀，加盖玻片用高倍镜检查。或刮取少量肠黏膜做成涂片，用姬氏或瑞氏液染色，在高倍镜下检查，若见到有大量裂殖体和裂殖子即可确诊。病畜禽采集病变部位肠内粪便5～10 g于100 mL烧杯中（或离心管中），加无菌水约50 mL搅拌使之沉淀，然后弃上清液，沉渣内加入饱和氯化钠溶液或饱和硫酸镁溶液，搅拌均匀后，取表层漂浮液于玻片上镜检，若见有大量卵囊即可确诊。或吸取少量于玻片中央轻轻涂匀，形成均匀薄片，干燥，染色，镜检。为加快检查时间，粪便处理溶液2 000 r/min离心，取上浮物检查，效果更好。

5）注意事项：涂片时必须细心操作，涂片要薄且均匀，尽快干燥，防止涂片粘连或腐败。

6）涂片的固定：自然干燥的涂片在染色前必须固定。酒精灯火焰固定：玻片背面在酒精灯火焰上来回3～5次，温度不宜过高，以玻片背面接触手背温热为准，否则可能使病原形态改变，影响观察结果；甲醇固定：用吸管或移液器取分析纯甲醇滴于涂片上，以充分覆盖病料涂层为准，使之自然干燥后才能染色。

3 染色液配制与染色方法

3.1 革兰氏染色液配制

革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法，可用于标本涂片或菌落涂片，染色后细菌与环境形成鲜明对比，可以清晰观察到细菌的形态、排列及某些结构特征，主要用于临床分类鉴定。临床实践中，也可用来染色血液原虫。革兰氏染色是由草酸铵结晶紫染液、碘溶液、脱色剂（乙醇）和沙黄染液4种染色液组成，按先后顺序（紫、碘、脱、黄）进行复合染色。

1）结晶紫染液：结晶紫5 g，95%乙醇100 mL，1%草酸铵水溶液400 mL，按先后顺序溶解混合，滤纸过滤后保存于棕色试剂瓶中备用。

2）碘溶液：碘（片）1 g，碘化钾2 g，蒸馏水 300 mL，溶解，保存于棕色试剂瓶中备用。

3）脱色剂为95%乙醇。

4）沙黄染液：沙黄 1.0 g，95%乙醇 40 mL，蒸馏水360 mL保存于试剂瓶中备用。

3.2 染色方法

染色方法共包括以下6个步骤：

1）先加结晶紫染色液，初染1～2 min，用纯净水或自来水缓缓冲洗后甩干。

2）加革兰氏碘液，媒染1～2 min，缓缓冲洗后甩干。

3）加95%乙醇，脱色10～20 s，缓缓冲洗后甩干。

4）加复红染液复染（沙黄复红染液或者石碳酸复红染液）1～2 min，冲洗后使之自然干燥，或用吸水纸、中性滤纸吸干。

5）显微镜检：革兰氏阳性细菌呈紫色，革兰氏阴性菌呈红色。

6）注意在染色时染色液可完全覆盖玻片涂层，并在规定的染色时间内保持液体不干为宜。

3.3 瑞氏染色液配制与染色

瑞氏染色液配制：取瑞氏染色素（粉）0.4 g（研磨），甲醇240 mL，充分溶解，滤纸过滤后，保存于棕色瓶中备用。

染色：适用于血液原虫和附红细胞体涂片的染色。用瑞氏染色液滴加在涂片上染色1～2 min，再加等量蒸馏水复染2 min，冲洗，干燥后镜检。

3.4 美蓝染色液配制与染色

取美蓝（亚甲基蓝）1.2 g，95%乙醇120 mL，0.1%氢氧化钾溶液400 mL，溶解混合后用滤纸过滤，保存于棕色瓶中备用。吸取染色液于涂片上染色2～3 min，冲洗干燥后镜检，虫体呈蓝色。

3.5 姬姆萨染色液配制与染色

取姬姆萨染色粉1.8 g，甘油150 mL，甲醇150 mL。先将姬姆萨染色粉与甘油混合，在55～60℃加温1～2 h后，再加甲醇混合静置1 d以上，用滤纸过滤后，置棕色瓶中备用（即为原液）。

姬姆萨染色（原液）的稀释：使用时，原液按1∶4用中性蒸馏水稀释后，即为工作染色液。

染色：适用于血液原虫染色。工作液滴加在涂片上染色约30 min，或将玻片置染色缸中泡染30 min，冲洗、干燥后镜检。

3.6 瑞氏-姬姆萨复合染色液

瑞氏-姬姆萨染色液，是利用瑞氏改良技术原理改良而成，适用于血液原虫涂片的染色。细胞的着色是染料透入被染物并存留其内部的过程，此过程既有物理吸附作用，又有化学亲合作用。各种细胞及细胞内的各种成分由于其化学性质不同，对瑞氏-姬姆萨染色液中的酸性染料(曙红)和碱性染料（亚甲蓝）的亲合力也不同。因此，涂片经瑞氏-姬姆萨染色液染色后，相应各类细胞呈现不同的着色，从而达到辨别其形态特征的目的。这种复合染色液可在市场上买到，染色时间短，只需3～5 min，染色效果好，价格便宜，在检验工作中经常使用。

3.7 商品染色液

若上述染色液配制困难，可直接采购商品染色液，方便且简单。目前许多实验室都采用商品化的染色液，如广东珠海贝索生物技术有限公司生产的染色液品种齐全，质量良好。

4 显微镜检查

4.1 普通光电显微镜检查

1）悬滴压片检查法。如猪、牛、羊、马等动物附红细胞体检查，可取新鲜血液少许于载玻片上，用微量液器加等量生理盐水混合，加盖玻片，在400～600倍低倍镜、暗视野下仔细观察多个视野，特别是玻片边缘区聚集虫体更多。附红体附着在红细胞表面，数量不等，红细胞外形呈锯齿状排列，并可使动物红细胞翻转或不规则运动，可确定为感染附红细胞体。感染严重伊氏锥虫者，也可用此法在2 h内的新鲜血或抗凝血中查到，超过2 h虫体会自行溶解。此外，球虫处理漂浮物、疥螨等也可用此法检查。

2）未染色血涂片镜检：血片涂好干燥后，未经染色也可在600倍以上的红细胞中检查到焦虫，但轮廓不太清晰，或在红细胞表面检查到清晰的附红细胞体。

3）染色涂片检查法。检查前，首先准备好性能良好和可正常使用的显微镜、擦镜纸、香柏油或高级油镜油。开启显微镜电源5 min后，将染色干燥的玻片置于样品台上，调整物镜、焦距、光源、滤光片等。先用10×10低倍镜观察视野中的物体，再依次用10×40、10×60的低倍镜观察到物体（血细胞或虫体），再用10×100高倍镜（油镜）观察，缓慢转动微调至观察物清晰时，滴加适量高级油镜油或香柏油检查，病原体的形态和着色情况会更加清晰。

油镜常用的香柏油，能够溶解复红等染料，使染色退色，但容易干燥凝结，对油镜造成损害，在发达国家已被禁用。目前国产的高级油镜油可以取代香柏油，使用完后，用镜头纸直接擦干镜头即可，无需使用二甲苯清洗。

4.2 显微图片采集

有条件的实验室，可采用带有照像系统的显微镜检查。如投影显微镜、奥林巴斯CX31型生物显微镜检查，并把显微图片采集下来作永久保存。无照相系统显微镜条件时，可用手机拍照。即将视野调到最清晰时，用像素高的手机对准物镜，轻轻调整到可清晰看到视野时拍照即可，这是笔者在多年工作实践中发现的一种既方便又快速的图片保存方法。